Zu Beginn werden HEK293A Zellen auf glänzenden Deckgläsern in eine 24-Well-Platte mit hohem Glukose-DMEM gelegt, bis sie zu 80 % zusammenfließen. Am nächsten Tag hungerten die Zellen zwei Stunden lang in Earls ausgewogener Salzlösung. Nach der Behandlung wird das Medium abgesaugt und 500 Mikroliter oder 4%ige Formaldehydlösung in PBS gegeben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Zellen zu fixieren.
Nach der Fixierung wird die Formaldehydlösung durch 500 Mikroliter PBS ersetzt. Als nächstes wird die freie Aldehydgruppe abgeschreckt, indem 500 Mikroliter 50 Millimolar Ammoniumchloridlösung in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben werden. Ersetzen Sie die Ammoniumchloridlösung durch 500 Mikroliter einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Digitonin-Lösung in PBS für fünf Minuten, um die Zellen zu permeabilisieren.
Ersetzen Sie nach der Permeabilisierung die Digitoninlösung durch 500 Mikroliter PBS und wiederholen Sie das PBS-Waschen dreimal. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 500 Mikrolitern Blockierungslösung inkubiert. Nach der Inkubation wird die Blockierungslösung durch 500 Mikroliter PBS ersetzt.
Sammeln Sie dann mit einer Pinzette die Deckgläser aus der Vertiefung und entfernen Sie das überschüssige PBS mit dünnen Tüchern. In der befeuchteten Kammer wird das Deckglas vorsichtig mit der Zellseite nach unten auf einen 50-Mikroliter-Tropfen der primären Antikörperlösung gelegt. Inkubieren Sie die Zellen in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation werden die Deckgläser gesammelt und die überschüssige Primärantikörperlösung abgelassen. Legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben zurück in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Sammeln Sie nach der letzten Wäsche die Deckgläser und lassen Sie das überschüssige PBS abtropfen, bevor Sie jedes Deckglas mit der Zellseite nach unten auf einen 50-Mikroliter-Tropfen sekundäre Antikörperlösung legen.
Eine Stunde lang in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Nach der Inkubation die überschüssige Sekundärantikörperlösung abtropfen lassen und das Deckglas dreimal mit 500 Mikrolitern PBS in der 24-Well-Platte waschen. Nach dem Ablassen von überschüssigem PBS legen Sie jedes Deckglas mit der Zellseite nach unten auf einen 50-Mikroliter-Tropfen Hakenlösung, die eins bis 4.000 in PBS in einer befeuchteten Kammer verdünnt ist.
Fünf Minuten in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Entfernen Sie als Nächstes die überschüssige Hakenlösung und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS und einmal mit deionisiertem Wasser in einer 24-Well-Platte. Nachdem Sie überschüssiges deionisiertes Wasser abgelassen haben, legen Sie jedes Deckglas auf einen 10 bis 20 Mikroliter fassenden Tropfen der Montagelösung, die auf einem Objektträger getupft ist, und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
