Für die Lebendzell-Bildgebung von ATG9A-Konstrukten werden HEK293A Zellen in zwei Milliliter DMEM mit hohem Glukosegehalt in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale gesät, bis sie eine Konfluenz von 65 bis 70 % erreichen. Bereiten Sie am nächsten Tag die Lipofectamin-DNA-Mischung vor, geben Sie sie in die Zellkulturplatte mit vier Millilitern Wachstumsmedium und wiegen Sie die Platte vorsichtig hin und her, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid.
Nach vier Stunden Transfektion wird das Wachstumsmedium durch ein frisches Medium ersetzt und die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 10 % Kohlendioxid inkubiert. Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zugabe von Trypsin EDTA trypsinisiert. Zählen Sie dann die abgelösten Zellen und säen Sie sie über Nacht auf einer Kulturschale aus, die für die Lebendmikroskopie geeignet ist.
Am nächsten Tag werden die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Unter basalen Bedingungen ist ATG9A hauptsächlich im Golgi-Netzwerk lokalisiert, was durch die Immunfluoreszenz des endogenen Proteins angezeigt wird, und überlappt sich mit GM130, einem cis-Golgi-Marker. eGFP N-terminally-tagged ATG9A und mRFP N-terminally tagged ATG9A waren am Golgi weniger lokalisiert und befanden sich hauptsächlich in Vesikel.
Im Gegensatz dazu ist eGFPc, das mit ATG9A terminalisiert ist, anfälliger für Aggregationen innerhalb der Zelle. Die Fusion einer 3x-FLAG-Sequenz zwischen einem N-terminalen Fluorophor und ATG9A half dem überexprimierten Protein, sich ähnlich wie das endogene zu verhalten. Das überexprimierte mCherry 3x-FLAG ATG9A kolokalisiert mit dem Golgi-Marker GM130 unter fütterten Bedingungen.
Diese Lokalisation und das vesikuläre Kompartiment von AG9A blieben über die Zeit erhalten, was eine raumzeitliche Untersuchung des Transports von ATG9A ermöglichte.
