Zu Beginn wird die geopferte 10 Wochen alte männliche C57 Black 6J Maus gründlich mit 70%igem Ethanol besprüht. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Haut von der Hintergliedmaße und präparieren Sie alle Gliedmaßenmuskeln, die den Oberschenkelknochen, das Schienbein und das Wadenbein umgeben. Legen Sie die entnommenen Gliedmaßenmuskeln in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter Muskelisolationspuffer enthält.
Und mit einer Schere die geernteten Muskeln zerkleinern. Die gehackte Muskelsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 18 Millilitern Muskelisolationspuffer überführen. Verschließen Sie das Röhrchen fest, verschließen Sie es mit Laborfolie und legen Sie es waagerecht in ein schüttelndes Wasserbad.
Fügen Sie nach 30 Minuten fünf Milligramm Typ-I-Kollagenase hinzu und lassen Sie das Röhrchen weitere 30 Minuten lang stehen. Nachdem Sie die Muskelsuspension 10 Mal auf und ab pipettiert haben, zentrifugieren Sie den Überstand und verwerfen Sie ihn, wobei fünf Milliliter des Mediums im Röhrchen verbleiben. Pipettieren Sie die Suspension auf die aufeinanderfolgenden Zellsiebe und sammeln Sie den Durchfluss in das 50-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Suspension und verwerfen Sie den Überstand, bis nur noch 100 bis 200 Mikroliter im Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Lysepuffer der roten Blutkörperchen und inkubieren Sie es drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie den Überstand mit einer 20- bis 200-Mikroliter-Pipette aus dem Röhrchen.
Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikroliter kaltem FACS-Puffer und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Nach dem Entfernen von 10 Mikrolitern Zellsuspension für die Negativkontrolle zentrifugieren Sie die verbleibenden 90 Mikroliter und verwerfen den Überstand, bevor Sie die Zellen mit 400 Mikrolitern fixierbarer Viabilitätsfarbe, verdünnt in serumfreiem DMEM für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie nach der Zentrifugation 100 Mikroliter FACS-Puffer hinzu und drehen Sie das Röhrchen dreimal vorsichtig um.
Erneut zentrifugieren und 100 Mikroliter Primärantikörpermischung in das Röhrchen geben. Nach 30 Minuten Inkubation im Dunkeln zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS hinzu, um die Zellen zu waschen.
Zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 500 Mikroliter FACS-Puffer resuspendieren. Die Suspension wird in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen überführt. Die Zellsuspension kurz vortexen, bevor sie auf einem Durchflusszytometer verarbeitet wird.
Sammeln Sie die ausgewählten Zellen in dem fünf Milliliter beschichteten Röhrchen, das den FACS-Puffer enthält. 75 % der einkernigen Zellen, die aufgrund ihrer Größe und Granularität identifiziert wurden, waren negativ für den Marker für die fixierbare Viabilitätsfärbung, was zu einem Durchschnitt von 34,3 % lebender Zellen führte. Etwa 3 % der einzelnen lebenden Zellen waren negativ für monozyten-, endotheliale, leukozyten- und erythroide spezifische Marker.
Diese negativen Zellen wurden dann nach ihrer Expression von CD34- und ITGA7-Markern selektiert. Ein abschließendes Gating für CXCR4 wurde durchgeführt, um mutmaßliche Satellitenzellen zu selektieren. Und von den CD34-positiven ITGA7-positiven Zellen waren 80% positiv für CXCR4.
