Am Tag Null wurden 10 Millionen 293T-Zellen in 30 Millilitern antibiotikafreiem DMEM mit 10 % FBS in einer 15-Zentimeter-Schale aufgelistet. Bereiten Sie insgesamt 10 solcher Gerichte zu. Vergewissern Sie sich am nächsten Tag, dem ersten Tag, dass die Zellen zu 80 % konfluent und bereit für die Transfektion sind.
Geben Sie dann in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen nacheinander 600 Mikroliter 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter Verpackungsplasmidmischung und 60 Mikroliter Plasmid-Barcode-Bibliothek hinzu. In einem separaten konischen 15-Milliliter-Röhrchen werden 900 Mikroliter Transfektionsreagenz und 12 Milliliter DMEM durch Vortexing gemischt. Fügen Sie 12,9 Milliliter dieser Mischung zur DNA-Mischung hinzu und schnippen Sie sie einfach, um sie zu vermischen.
Ohne weiter zu mischen, inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann tropfenweise 2,5 Milliliter der inkubierten Mischung in jede 15-Zentimeter-Schale, die die 293T-Zellen enthält, und inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator. Am dritten Tag ernten Sie das Virus, indem Sie das Medium durch eine 0,2-Mikron-Filtereinheit leiten.
Aliquotieren Sie das Filtrat mit den Viruspartikeln in konische 15-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie zusätzlich fünf Aliquots des gefilterten Virus von einem Milliliter in Kryo-Fläschchen für die Virustiterisierung vor. Um die lentiviralen Pools zu titrieren, geben Sie 65 Mikroliter kationisches Polymer in einen sterilen Glaskolben, der 65 Milliliter Tumorzellwachstumsmedium enthält.
Pipettieren Sie einen Milliliter des polymerhaltigen Mediums pro Well in 11 Sechs-Well-Gewebekulturplatten. Als nächstes werden die frühen Tumorzellen trypsinisiert. Nachdem Sie die Zellen mit einer bevorzugten Methode gezählt haben, übertragen Sie die Zellen in die Sechs-Well-Platten.
Die Ein-Milliliter-Aliquots des 48-Stunden-Lentivirus aus dem Gefrierschrank in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen. Befolgen Sie die Tabelle, um die Infektion für jedes Virusmodul vorzubereiten.
