Beginnen Sie mit der Vorbereitung des vollständigen Endothelkulturmediums mit 460 Millilitern Endothelzellmedium und fügen Sie 50 Milliliter FBS, fünf Milliliter Penicillin-Streptomycin und fünf Milliliter Endothelzellwachstumsergänzung hinzu. Die vorbereiteten Medien können einen Monat lang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Als nächstes werden in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit 0,1 Millionen Gefäßzellen bei acht Millilitern des vorbereiteten vollständigen Endothelkulturmediums die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert, bis 70 % Kofluenz erreicht sind.
Nehmen Sie dann das Kulturmedium aus der Schale und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um nicht angeschlossene Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Nach dem Entfernen des PBS drei Milliliter 0,25%iges Trypsin mit 2,21 Millimolar EDTA zu den Zellen geben und die Schale eine Minute lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
Neutralisieren Sie das Trypsin mit sieben Millilitern vollständigem endothelialem Kulturmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig von der Kulturschale ab. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, nachdem Sie sie 10 Minuten lang in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 400 g gesammelt haben. Nach dem Entfernen des Überstands werden die Zellen in fünf Millilitern vollständigem endothelialem Kulturmedium erneut suspendiert, dann die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und ein berechnetes Suspensionsvolumen mit 2 Millionen Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt.
Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 400 g zentrifugieren, bevor Sie den Überstand entfernen. Die Gefäßzellen sind nun bereit für das Mischen mit dem Matrixgel für den Matrix-Gel-Plug-Assay.
