Die Autoren danken Linda Turner für die Unterstützung bei mikrobiologischen Herstellung. RZ und LGW wurden vom Rowland Institute der Harvard und CGB finanziert wurde als CAPES Stiftung Gelehrte, Wissenschaft ohne Grenzen Programm, Brasilien (Verfahren Nr. 7340-11-7) gefördert

1. Setup-und Datenkommunikation <ol><li> Wachsen einer Kultur von Streptococcus-Stamm V4051-197 (glatte Schwimmen) Zellen in KTY Medium aus der Tiefkühl 22. Inkubieren in einem Rundschüttler über Nacht bei 35 ° C und 150 UpM bis zur Sättigung. </li><li> Beimpfen von 10 ml frischem KTY Medium mit 500 &amp;mgr; l der gesättigten Kultur. Inkubation für weitere 3,5 h bei 35 ° C und 150 Upm, bis die Zellen erreichen eine optische Dichte von etwa 1,0 bei λ = 600 nm (etwa 5 x 10 8 Zellen / ml). </li><li> Verdünnt 1:400 in frischem Medium auf eine Endkonzentration von beweglichen Zellen zu erhalten. </li><li> Auf einen Objektträger, einen Ring von Fett (zB aus einer Spritze mit Vaseline gefüllten) um 1 mm in der Höhe und einen Tropfen der Probenlösung in der Mitte. Legen Sie ein Deckglas oben und drücken Sie leicht an den Kanten zu versiegeln, sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in Kontakt mit beiden Träger und Deckglas. Die daraus resultierende Probenkammer sollte arou seinnd 100-200 um in die Tiefe. </li><li> Setzen Sie die Probenkammer im Mikroskop mit dem Deckglas nach unten, und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen in dem Öl zwischen Glas und Linse zu verhindern. </li><li> Fokussierung des Mikroskops auf der Bodenfläche der Probenkammer, und bringen den Kondensator zu konzentrieren. </li><li> Schalten Sie die Standardbeleuchtung und legen Sie den LED-Kopf hinter dem Kondensator Apertur des Mikroskops. Stellen Sie die LED-Stromversorgung für maximale Leistung. </li><li> Schließen Kondensorapertur in vollem Umfang, und wenn nötig, verschieben die Leuchtdiode in der Halterung, bis die Beleuchtung auf der Objektivlinse Öffnung mittig. </li><li> Schalten Sie den Computer und der Kamera, und leiten alles Licht, um Kamera-Anschluss des Mikroskops. Passen Sie die Bildrate und die Bildgröße in der Bildaufnahme-Software. </li><li> Machen Sie den Bild-Belichtungszeit so kurz wie möglich unter Beibehaltung guten Kontrast. Überprüfen einer Bildintensitätshistogramm, um sicherzustellen, dass das Bild nicht saturaTED-oder unterbelichtet. </li><li> Wenn nötig, neu auszurichten, so dass das Mikroskop Objekt von Interesse leicht (in der Regel von 10 bis 30 um) defokussiert. Das Objekt und der Brennebene sollten im gleichen Medium (dh die Brennebene sollten innerhalb der Probenkammer liegen). </li></ol> 2. Wiederaufbau Der erste Schritt der Datenverarbeitung ist die numerisch refokussieren ein Videobild in einer Reihe von verschiedenen Tiefen, wodurch ein Stapel von Bildern. : Benutzerfreundliche Software, dies zu tun finden Sie hier <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> zusammen mit B. Bilder (mit einem inversen Mikroskop erfasst und einem 60X Ölimmersions-Objektiv) und eine Szene-Datei für Raytracing Rendering. <ol><li> Eingang der Rahmen von Interesse und deren jeweiligen Hintergrund als separate Bilddateien in die entsprechenden Felder auf der Schnittstelle. Ein Hintergrundbild ist ein Rahmen, fairly stellt den Hintergrund des Videos, in Abwesenheit des Hologramms, und wird verwendet, um eine Festmusterrauschen, das mit dem Hologramm Lokalisierung und Analyse stören könnten, zu unterdrücken. </li><li> Werte eingeben, bevor Sie das Programm in den globalen Einstellungen Boxen auf der linken Seite des Bildschirms. Die ersten drei sind Stack-Parameter Ausgang: Axial Position des ersten Rahmen (&#39;Start Fokus&#39;), Anzahl der Scheiben in der rekonstruierten Stapel (&#39;Anzahl der Schritte&#39;); axiale Abstand zwischen jeder Scheibe im Stapel (&#39;Schrittweite&#39;) . </li><li> Um Objekte mit den richtigen Proportionen zu rekonstruieren, sollte die Schrittweite die gleiche Größe wie die laterale Pixelabstand sein. Geben Sie der Kamera seitlichen Abtastfrequenz (1/pixel Abstand) in der &#39;Pixel / micron&#39; Box, die Belichtungswellenlänge und mittleren Brechungsindex in den letzten zwei Boxen. Die Standardwerte des Programms sind für die Rekonstruktion der Daten beispielsweise geeignet. </li><li> Drücken Sie die Taste &#39;Flip Z-Gradienten &quot;, wenn der Mittelpunkt der object ist dunkel in dem Hologramm (siehe Beispiel Rahmen 2005 und die Diskussion Abschnitt für weitere Details). </li><li> Überprüfen Sie die Bandpassfilter ein / aus (default ist). Diese optionale Bandpass-Filter, in einer Box unter dem Verlaufs-Flip-Schalter befindet, ist für die Unterdrückung der Beitrag laut Pixel verantwortlich. Der Bandpass-Filter auf jedem Bild Scheibe unmittelbar nach Generation angewendet. </li><li> Überprüfen Sie die Zwischenausgangs Ein-/ Aus-Zustände (Standard ist). Zwischenanalyse Schritte sind in zwei Ausgangsvideos als unkomprimierte geschrieben, avi Dateien:. Ist die erste der neu ausgerichteten Stapel (Dateinamen, die auf &#39;_stack.avi&#39;), der zweite ist der Stapel nach der axialen Gradienten Operation (Dateiname, die auf &#39; _gradient.avi). Im Idealfall wird diese zweite Stapel enthalten das Objekt von Interesse hervorgehoben als ein helles Objekt vor einem dunklen Hintergrund. </li><li> Nach Einstellung aller Parameter, drücken Sie &quot;Ausführen&quot; im Hauptfenster. Der ausgewählte Rahmen wird im Hauptfeld der Software angezeigt. </li><li> Verwenden Sie dieLupe-Werkzeug in der Werkzeugleiste auf der linken Seite das Bild, um es zu vergrößern (linke Maustaste) und verkleinern (Shift + linke Maustaste) gefunden. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um eine Region of Interest (ROI) zu wählen. Zu erfassen, wie viele Streifen des Hologramms wie möglich innerhalb des Rechtecks, da dies die Wieder optimieren. </li><li> Drücken Sie die &quot;Process&quot;-Taste, um die beiden Bildstapeln zu generieren. Überprüfen Sie die resultierende Stapel mit ImageJ (die kostenlos zur erhalten werden können <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Wenn das Objekt von Interesse eindeutig im Gradienten Bildstapel gesehen werden, zu dem nächsten Schritt fort, um die Objektkoordinaten zu extrahieren. </li></ol> 3. Rendering <ol><li> Neben Rahmen Neuausrichtung kann dieses Programm finden die x-, y-, z-Koordinaten für jedes Voxel in dem Objekt von Interesse. Drücken Sie die &quot;Feature Extraction&quot;-Taste, um diese Funktion zu aktivieren. </li><li> Geben Sie einen Pfad, einschließlich Erweiterung (zB: c: home output.inc), für dieAusgangskoordinaten-Datei. Wählen Sie &quot;POV-Ray-Stil&quot; in der &quot;Ausgabe-Koordinaten Stil&quot;-Box. Dies bewirkt, dass das Programm auf eine Objektdatei, die mit der kostenlosen POV-Ray Raytracing-Software-Paket (das gewonnen werden kann visualisiert werden kann schreiben <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Nachbearbeiten der Bilder, wie in Abschnitt 2 oben. Das Programm wird eine Reihe von (x, y, z)-Koordinaten in der gewählten ROI, an den Dateinamen in der &quot;Output koordinieren&quot; Feld geschrieben. Extraktion von Objektkoordinaten dauert deutlich länger als Stack-Generation. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Probe POV-Ray-Datei (mit der Rekonstruktion Code geliefert) in dem gleichen Ordner wie die Datei nur Koordinaten erzeugt. Bearbeiten Sie die Probe. Pov-Datei und ersetzen Sie den Dateinamen in Anführungszeichen auf der Linie # Include &quot;MYFILE.inc&quot; mit dem Namen der durch den Rekonstruktionsdatendatei Code generiert. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Ausführen&quot;-Button in POV-Ray, ein Bitmap-Bild zu machen. Ter Kameraposition, Beleuchtung und Textur-Optionen sind nur einige der Anpassungen in POV-Ray möglich, siehe die Online-Dokumentation. </li></ol>

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	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der wichtigste Schritt in diesem Versuchsprotokoll ist die genaue Erfassung von Bildern von einer stabilen experimentellen Aufbau. Bei schlechten Hintergrunddaten, ist High-Fidelity-Rekonstruktion unmöglich. Es ist auch wichtig, Objektivlinsen mit einer internen Phasenkontrastelement (als dunkler Kreisring beim Blick durch die Rückseite des Ziels sichtbar ist) zu vermeiden, da dies das rekonstruierte Bild verschlechtern. Das Objekt des Interesses sollte weit genug von der Brennebene, die ein paar Paare von Beugungsstr...

Inline-Digital-holographische Mikroskopie (Dihm) ermöglicht die schnelle dreidimensionale Bildgebung von mikroskopischen Proben, wie Schwimmen Mikroorganismen 1,2 und Soft Matter 3,4 Systeme mit minimalen Änderungen an einer Standard-Mikroskop-Setup. In diesem Papier eine pädagogische Demonstration Dihm vorgesehen ist, um Software in unserem Labor entwickelt zentriert. Dieses Papier enthält eine Beschreibung, wie Sie das Mikroskop, Optimierung der Datenerfassung und Verarbeitung der aufgenommenen Bilder zu dreidimensionalen Daten zu rekonstruieren. Das Software-und beispielsweise Bilder (zum Teil auf Software von der GD Grier und andere entwickelten fünf) sind auf unserer Website frei verfügbar. Eine Beschreibung der notwendigen Schritte, um das Mikroskop zu konfigurieren, zu rekonstruieren dreidimensionale Volumen von Hologrammen und machen die daraus resultierenden Volumina von Interesse mit einem kostenlosen Ray-Tracing-Software-Paket zur Verfügung gestellt. Der Beitrag schließt mit einer Diskussion der Faktoren, die die Qualität der RekonstruktionUnd ein Vergleich der Dihm mit konkurrierenden Verfahren. Obwohl Dihm wurde vor einiger Zeit beschrieben (für eine allgemeine Überprüfung der Grundlagen und Entwicklung, siehe Kim 6), die erforderliche Rechenleistung und Bildverarbeitung Know-how hat sich bisher weitgehend seine Verwendung an Facharbeitsgruppen mit Fokus auf Instrumentenentwicklung beschränkt. Diese Situation ändert sich im Licht der jüngsten Fortschritte in der Computer-und Kameratechnik. Moderne Desktop-Computer kann problemlos mit der Verarbeitung und Datenspeicheranforderungen zu bewältigen; CCD-oder CMOS-Kameras sind in den meisten Labors Mikroskopie vorhanden ist und die erforderliche Software wird frei verfügbar im Internet von Gruppen, die sich Zeit für die Entwicklung, die Technik investiert haben. Verschiedene Schemata sind für die Abbildung der Konfiguration von mikroskopischen Objekten in einem dreidimensionalen Probenvolumen vorgeschlagen. Viele davon sind 7,8-Scan-Techniken, bei dem ein Stapel von Bildern aufgezeichnet wird, indem mechanically Übersetzen der Bildebene durch die Probe. Konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist vielleicht das bekannteste Beispiel. Typischerweise wird ein Fluoreszenzfarbstoff an ein Phasenobjekt, um ein akzeptables Niveau der Probe Kontrast zu erzielen zugegeben und die konfokalen Anordnung verwendet werden, um räumlich zu lokalisieren Fluoreszenzemission. Dieses Verfahren hat erhebliche Fortschritte, beispielsweise in Kolloid-Wissenschaft, wo es Zugang zu den dreidimensionalen Dynamik voll Systeme 9-11 erlaubt geführt. Die Nutzung der Kennzeichnung ist ein wichtiger Unterschied zwischen der konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Dihm, aber auch andere Merkmale der beiden Techniken sind ein Vergleich lohnt sich. Dihm hat einen erheblichen Geschwindigkeitsvorteil, dass die Vorrichtung keine beweglichen Teile. Mechanischen Abtastspiegeln in Konfokalsystemen platzieren eine Obergrenze Datenerfassungsrate - typischerweise um 30 Frames / sec für Pixelbild 512 x 512. Ein Stapel solcher Bilder aus verschiedenen Fokusebenen kann durch physikalisches transl erhalten werdentriebs der Probentisch oder Objektivlinse zwischen den Bildern, die zu einer endgültigen Erfassungsrate von etwa einem Volumen pro Sekunde für eine 30-Frame-Stack. Im Vergleich dazu kann ein holographisches System basierend auf einem modernen CMOS-Kamera 2000 Bildern / sec bei der gleichen Bildqualität und Auflösung zu erfassen, wobei jeder Frame &#39;offline&#39; verarbeitet, um eine unabhängige Snapshot des Volumens der Probe zu geben. Um es zu wiederholen: fluoreszierende Proben nicht für Dihm erforderlich, obwohl ein System entwickelt worden, das holographische Rekonstruktion eines fluoreszierenden Gegenstand 12 führt. Sowie dreidimensionaler Volumeninformation, Dihm kann auch verwendet werden, um quantitative Phasenkontrastaufnahmen 13 vorzusehen, aber das ist nicht Gegenstand des hier diskutierten. Raw-Daten Dihm Bilder sind zweidimensional, und in mancher Hinsicht aussehen wie Standard-Mikroskopbilder, wenn auch unscharf. Der Hauptunterschied zwischen Standard-und Dihm Hellfeldmikroskopie liegt in den Beugungsringen umgeben, die Objekte in das Sichtfeld, das sind durch die Art der Beleuchtung. Dihm erfordert eine kohärentere Quelle als helles Feld - in der Regel eine LED oder Laser. Die Beugungsringe im Hologramm enthält die notwendigen Informationen, um ein dreidimensionales Bild zu rekonstruieren. Es gibt zwei Hauptansätze zur Interpretation Dihm Daten; direkte Montage und numerische Neuausrichtung. Der erste Ansatz ist in Fällen, in denen die mathematische Form des Beugungsmusters wird im Voraus bekannt 3,4 anwendbar, wird dieser Zustand durch eine kleine Handvoll einfache Objekte wie Kugeln, Zylinder und Halbebene Scheide. Direkte Montage ist auch in Fällen, in denen das Objekt axialen Position bekannt ist zutreffend, und das Bild kann unter Verwendung einer Look-up-Tabelle von Bildvorlagen 14 ausgestattet werden. Der zweite Ansatz (numerische Refokussierung) ist eher allgemein und beruht auf der Verwendung der Beugungsringe in dem zweidimensionalen Bildhologramm zur numerischen Rekonstruktion des optischen Feldes aneine Anzahl von (willkürlich) beabstandet Brennebenen der gesamten Probenvolumen. Mehrere verwandte Methoden existieren, dies zu tun 6; diese Arbeit verwendet die Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation-Technik, wie von Lee und Grier 5 beschrieben. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist ein Stapel von Bildern, die die Wirkung der Brennebene des Mikroskops (daher der Name `numerische Neuausrichtung &#39;) manuell ändern zu replizieren. Sobald ein Stapel von Bildern erzeugt worden ist, muss die Position des Objekts in der Brennvolumen erhalten werden. Eine Anzahl von Bildanalyseheuristiken, wie lokale Intensitätsvarianz oder räumliche Frequenzgehalt, wurden vorgestellt, um die Bildschärfe an verschiedenen Stellen in der Probe 15 zu quantifizieren. In jedem Fall, wenn ein bestimmtes Bildmetrik maximiert (oder minimiert), wird das Objekt als im Mittelpunkt. Im Gegensatz zu anderen Systemen, die auf eine bestimmte Brennebene, wo sich ein Objekt &quot;im Fokus&quot; identifizieren zu suchen, das Verfahren in dieser Arbeit holt sich punkte, die in das Objekt von Interesse liegen, die in einem breiten Spektrum von Brennebenen erstrecken kann. Dieser Ansatz ist auf ein breites Spektrum von Themen und eignet sich besonders für ausgedehnte, schwach streuenden Proben (Phase-Objekte), wie stabförmige Kolloide, Ketten von Bakterien oder eukaryotischen Flagellen. In diesen Proben ändert sich die Bildkontrast, wenn das Objekt durch die Fokusebene verläuft, eine defokussierte Bild hat ein Lichtzentrum, wenn das Objekt auf einer Seite der Bildebene und einer dunklen Mitte, wenn es auf der anderen. Reine Phasenobjekte haben wenig bis keinen Kontrast, wenn sie genau in der Brennebene liegen. Dieses Phänomen der Kontrastinversion von anderen Autoren 16,17 diskutiert und letztlich aufgrund der Gouy-Phase Anomalie 18. Dies wurde auf einer strengeren berechtigt im Kontext der Holographie setzen an anderer Stelle, wo die Grenzen der Technik ausgewertet, die typische Unsicherheit in der Position ist, in der Größenordnung von 150 nm (ca. ein Pixel) in each Richtung 19. Die Gouy-Phase Anomalie-Methode ist eine der wenigen gut definierten Dihm Systeme zur Bestimmung der Struktur ausgedehnter Objekte in drei Dimensionen, aber dennoch einige Objekte problematisch zu rekonstruieren sind. Objekte, die direkt entlang der optischen Achse (die auf die Kamera) liegen, sind schwierig genau zu rekonstruieren; Unsicherheiten in der Länge und der Position des Objektes groß werden. Diese Einschränkung ist zum Teil auf die eingeschränkte Farbtiefe der Pixel Aufzeichnung des Hologramms (die Anzahl der verschiedenen Graustufen, die die Kamera aufnehmen kann). Ein weiterer problematischer Konfiguration tritt auf, wenn das Objekt von Interesse ist sehr nahe an der Brennebene. In diesem Fall werden die reale und virtuelle Bilder des Objekts in unmittelbarer Nähe wieder aufgebaut, was zu komplizierte optische Felder, die schwer zu interpretieren sind. Eine zweite, etwas weniger wichtiges Anliegen dabei ist, dass die daraus resultierenden Beugungsstreifen besetzen weniger von der Bildsensor, und das gröbere informationen führt zu einer schlechteren Qualität Wiederaufbau. In der Praxis wird ein einfacher Farbverlauf-Filter, um dreidimensionale rekonstruierten Volumen angewendet starke bis Inversionen entlang der Beleuchtungsrichtung zu erkennen. Regionen, in denen Intensitätsänderungen schnell von hell nach dunkel oder umgekehrt, werden dann mit Streubereiche verbunden. Diese einzelnen Beiträge Summe, um die Gesamtstreufeld, das einfach mit dem Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren invertiert geben; schwach streuenden Objekte sowie eine nicht wechselwirkenden Erhebung solcher Elemente 20 beschrieben. In dieser Arbeit wird die axiale Intensitätsverlauf Technik mit einer Kette von Streptococcus Zellen angelegt. Die Zellkörper sind Phasenobjekte (der Spezies E. coli hat einen Brechungsindex, gemessen 21 bis 1,384 bei einer Wellenlänge λ = 589 nm sein, der Streptococcus-Stamm dürfte ähnlich sein) und erscheinen als ein Hochintensität-Kette von verbundenen Blobs the Probenvolumens nach dem Gradienten-Filter aufgebracht wurde. Standard auf diesem gefilterten Volumen angewendet Schwelle und Merkmalsextraktion Methoden ermöglichen die Extraktion von volumetrischen Pixel (Voxel), die der Region in den Zellen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es eine eindeutige Rekonstruktion der Position eines Objekts in der axialen Richtung. Ähnliche Verfahren (zumindest diejenigen, die Aufzeichnung von Hologrammen in der Nähe des Objekts durch ein Mikroskopobjektiv abgebildet) leiden darunter, nicht in der Lage, die Zeichen für diese Verschiebung zu bestimmen. Obwohl die Rayleigh-Sommerfeld-Rekonstruktionsverfahren ist auch Zeichen-unabhängige in diesem Sinne ermöglicht die Gradientenbetrieb uns, zwischen schwacher Phasenobjekte oberhalb und unterhalb der Fokusebene zu unterscheiden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Schwach streuende Objekte, wie beispielsweise kleine kolloidale Partikel und die meisten biologischen Zellen, sind in der Mikroskopie häufig angetroffen. In der Tat eine Reihe von Techniken entwickelt worden, um diese Phase Objekte besser zu visualisieren, Phasenkontrast und DIC gehören zu den beliebtesten Methoden zur Verbesserung der Kontrast. Jedoch bleibt Aufzeichnungs Position und Form in der Richtung außerhalb der Abbildungsebene herausfordernd. Dieser Bericht stellt eine einfache experimentelle Methode, um die Position und Geometrie der Objekte in drei Dimensionen genau zu bestimmen, mit digitalen Inline-holographische Mikroskopie (Dihm). Grob gesagt, ist die zugängliche Probenvolumen von der Kamera Sensorgröße in der seitlichen Richtung und der Beleuchtungskohärenz in axialer Richtung definiert. Typische Probenvolumina reichen von 200 um x 200 um x 200 um unter Verwendung LED-Beleuchtung, um5 mm x 5 mm x 5 mm oder mehr unter Verwendung von Laserbeleuchtung. Dieses Beleuchtungslicht wird so konfiguriert, daß ebene Wellen treffen auf die Probe. Objekte im Probenvolumen dann streuen Licht, das mit dem nicht gestreuten Licht stört den Interferenzmuster senkrecht zur Beleuchtungsrichtung bilden. Dieses Bild (das Hologramm) enthält den Tiefeninformationen für dreidimensionale Rekonstruktion erforderlich und kann auf einem Standard-Bildgebungsvorrichtung, wie eine CMOS-oder CCD-Kamera aufgenommen werden. Die Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren wird eingesetzt, um numerisch konzentrieren Mikroskopbilder, und eine einfache Heuristik Bildgebung auf der Grundlage der Gouy-Phase Anomalie wird verwendet, um zu identifizieren Streuobjekten im rekonstruierten Volumen. Diese einfache, aber robuste Methode ergibt sich eine eindeutige, Modell freie Messung der Lage und Form von Objekten in mikroskopischen Proben.

Um die Funktionen des Dihm zu demonstrieren, wurden Versuche an einer Kette von Streptococcus-Bakterien durchgeführt. Die Kette selbst gemessen 10,5 mm lang und wurde von 6-7 sphärozylindrische Zellen (zwei der Zellen in der Kette sind in der Nähe Division) mit Durchmessern im Bereich von 0,6 bis 1 um zusammen. 1a und 1b die wichtigste Schnittstelle zeigen des Wiederaufbaus und der Rendering-Software. Beispiele der numerischen Refokussierung Verfahrens sind in Fig. 2...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K Aufrufe.  Harvard University.  Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten. 

Serie: Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

Bestimmen Hitze und mechanische Schmerzschwelle in entzündeten Haut von Probanden

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Forschung

Biologie

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.