Wir möchten Patrick C. Wilson für monoklonale Antikörper CR9114 danken. Wir danken auch Debeauchamp Jennifer und Richard Webby für die ursprünglichen A/Anhui/1/13 Plasmide. Teilweise Unterstützung für diese Arbeit wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten vorgesehen finanzierte Programm Projektstipendium AI097092-01A1 und CEIRS (Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung, HHSN26620070010C). FK wurde von einem Erwin-Schrödinger-Stipendium (J 3232) aus dem österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) unterstützt.

1. Erzeugung von rekombinantem Baculovirus <ol><li> Die Klonierung in Baculovirus-Transfer-Plasmide <ol><li> Klon H7 HA und NA N9 Ektodomäne (oder jede andere HA oder NA-Gen) in modifizierte pFastBac Transferplasmide (siehe Einleitung). Vektoren für die HA mit einer C-terminalen Domäne und Trimerisierung einen Hexahistidin-Tag, wie auch für NA, das einen N-terminalen Tetramerisierungsdomäne und Hexahistidin-Tag, wurden beschrieben, 1,10,11,22 (Fig. 1) und können angefordert werden, die Autoren. Erläuterung: HA Ektodomänen ausgedrückt ohne Trimerisierungsdomäne wird vor allem in den Stiel Domain falsch gefaltet werden, was zum Verlust von Konformationsänderungen neutralisierende Epitope. Ebenso stützt sich die NA enzymatische Funktion zur richtigen Tetramerisierungsdomäne. </li><li> Generierung von Bacmide Transformation Baculovirus-Transfer-Plasmide, die HA-und NA-Gene in Bakterien gemäß DH10Bac Verwendung eines Baculovirus-ExpressionsSystem gemäß Anweisungen des Herstellers. Isolieren und zu reinigen Bacmide mit einem Midiprep Kit nach Herstellerangaben (Abbildung 2). </li></ol></li><li> Rettung der rekombinanten Baculovirus und Überprüfung der Proteinexpression Erläuterung: Die folgenden Schritte müssen aseptisch in einer Sterildurchgeführt werden. Führen Sie dieses Verfahren unabhängig für HA und NA (oder jedes andere Gen von Interesse). Insektenzellen werden in der Regel bei 28 ° C ohne CO 2 gezüchtet. Sf9-Zellen für dieses Protokoll werden in voller TNM-FH Insektenzellmedium mit 10% FBS, 1% Pen-Strep * und 0,1% Pluronic F68-Lösung, ergänzt gewachsen, wenn nicht anders angegeben, agiert und 01.04 Uhr zweimal pro Woche. High Five-Zellen in Serum-freien Medien SFX gewachsen und agiert 01.15 Uhr zweimal pro Woche. * Zusatz von Antibiotika sollte in der gesamten Protokoll als optional angesehen werden und entsprechend den in jedem Labor eingesetzt Praktiken angepasst. <ol><li> Platte Sf9 Insektenzellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / cm 2 und stehen lassen für 20 Minuten in einem 28 ° C-Inkubator (ohne CO 2). </li><li> Mix 2 ug (konz. 0,5-2 ug / ul) von rekombinanter Bacmid mit 100 ul TNM-FH-Medium (serumfrei, 1% Pen-Strep). Mix 6 ul Transfektionsagens mit 100 ul TNM-FH-Medium (serumfrei, Pen-Strep). Kombinieren Sie die zwei Bände, vorsichtig mischen und lassen Sie sich für 20 Minuten bei Raumtemperatur (Transfektion Mischung). Fügen Sie ein Mock-Transfektion als Kontrolle (Abbildung 3). </li><li> Überstand entfernen aus beschichtetem Sf9-Zellen (Zellen werden nun auf die Platte kleben) und ersetzen mit 2 ml Serum-freiem TNM-FH-Medium, das Pen-Strep (1%). Fügen Sie das komplette Volumen der Transfektion Mischung (aus Schritt 1.2.2) und rocken die 6-Well-Platte vorsichtig 5 Sekunden. Inkubieren in einem 28 ° C Inkubator ohne CO 2 für 6 h (Fig. 3). </li><li> Ersetzen Medien with frisch TNM-FH-Medium (mit 10% FBS, 1% Pen-Strep und 0,1% Pluronic F68). Inkubation in einem 28 ° C-Inkubator ohne CO 2 für 6 Tage. Prüfen Sie gelegentlich Zellen unter dem Mikroskop. Infizierte Zellen in der Regel größer, runder erscheinen, haben Kerne vergrößert, und beginnen zu (Abbildung 4) zu lösen. </li><li> Ernte der Zellen und die Bestätigung der Proteinexpression <ol><li> Erntezellen 6 Tage nach der Transfektion durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Der Überstand enthält das rekombinante Baculovirus - diese werden verwendet, um Arbeitsstamm direkt zu erzeugen, oder können bei 4 ° C über Jahre gelagert werden. </li><li> Um die Proteinexpression überprüfen sammeln Pellets und resuspendieren in 500 ul PBS. Mischungs 50 ul der Suspension mit 50 ul SDS-PAGE-Ladepuffer (enthaltend ein Reduktionsmittel). SDS-PAGE laufen und führen eine Western Blot-Analyse mit einem anti-Hexa-Histidin-Antikörpers, um die Genexpression zu bestätigen. Fügen Zellen aus dem MockTransfektion als negative Kontrollen (Fig. 3). </li></ol></li><li> Herstellung der Arbeitsvorräte <ol><li> Platte 5 x 10 5 Sf9 Zellen / cm 2 in einem T175 cm 2-Kolben und lassen Sie sich für 20 Minuten damit sie in die Schale legen. Ersetzen vollständige TNM-FH-Medium mit TNM-FH-Medium mit 3% FBS (und 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68). </li><li> Infizieren Zellen mit 100 &amp;mgr; l des Überstands Rettungs. Inkubation in einem 28 ° C-Inkubator ohne CO 2 für 6 Tage und prüfen Sie gelegentlich, wenn die Zellen infiziert (wie in Schritt 1.2.5 beschrieben.). </li><li> Spin bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min und sammeln Stand. Das ist jetzt Ihre P2 Lager. Diese Aktie kann auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C gelagert werden Wiederholen Sie den Vorgang mit der Infektion 100 ul des Aktien P2, Zellen zu infizieren. Die daraus resultierende Aktien heißt P3 oder Arbeits Lager, die bei 4 ° C gelagert oder direkt für die Proteinexpression verwendet werden kann. Die P3-Lager enthält in der Regel 10 &lt;sup&gt; 7 10 9 Plaque-bildende Einheiten / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Erläuterung: Sf9-Zellen unterstützen das Wachstum von Baculovirus sehr gut. Allerdings ist ihre Fähigkeit, große Mengen an rekombinantem Protein zu sezernieren begrenzt. Deshalb verwenden wir eine andere Insektenzelllinie, High Five-Zellen, die für die Expression der sekretierten rekombinanten Proteinen. Diese Zellen unterstützen keine Baculovirus-Replikation auf sehr hohe Titer 13, aber haben hohe sekretorischen Kapazität. <ol><li> Growing up High Five-Zellen High Five-Zellen wachsen in SFX Insektenzellkulturmedium, in T175-cm 2-Kolben. Passage jeden zweiten Tag 01.03. Für eine 200 ml Expressionskultur müssen Sie 5 Flaschen konfluent wachsen. </li><li> Ernte und High Five-Zellen infizieren <ol><li> Nehmen High Five-Zellen von 5 T175 cm 2-Kolben, indem die Flaschen mit der Hand. Sammeln Sie die Zelle UntBrnsion und Transfer in 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spin bei 1200 × g für 7 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Dekantieren und vereinen die Pellets durch Resuspendieren in 15 ml P3 Lager. </li><li> Lassen Sie sitzen für 15 Minuten in der Flow-Haube (Abbildung 5). </li><li> Bringen Sie 200 ml Hyclone SFX Kulturmedium in einen sauberen, sterilen 1.000 ml Schüttelkolben (ohne buffles, mit Aluminiumfolie vor dem Autoklavieren verschlossen sind, müssen nicht für Bakterienkulturen verwendet haben). </li><li> Übertragen Sie die P3/cell Suspension in den Schüttelkolben. Siegel mit steriler Aluminiumfolie und Transferkolben in einen Shaker. Schütteln bei 70 Umdrehungen pro Minute bei 28 ° C für 72-96 Std. </li></ol></li><li> Ernten rekombinanten Protein aus High Five Zellexpressionsüberständen <ol><li> 72-96 Stunden nach der Infektion Übertragung Kulturüberständen in 500 ml Zentrifugation Eimer. Spin bei 5.500 × g für 20 min bei 4 ° C. In der Zwischenzeit spülen Sie die Schüttelkolben 3x mit doppelt destilliertem Wasser(DdH 2 O). </li><li> Übertragungs 3 ml Ni-Harz-Aufschlämmung in einen 50-ml-Röhrchen mit 45 ml PBS (man braucht pro 200 ml Kultur). Gut schütteln und drehen sich mit 3.000 × g bei Raumtemperatur für 10 min. Dekantiert die PBS und halten die Pellets. Mischen Sie die Insektenzellüberstand mit der Ni-Harz-Pellet und Überführung in den bereits gespült Schüttelkolben. Inkubation bei 4 ° C für 2-4 h unter Schütteln (Abbildung 6). </li><li> Berg 10 ml Polypropylen-Säule auf einer Klemme auf einem Standfuß. Entfernen Sie die beiden Kappen und setzen Sie ein Becherglas unter der Spalte um den Fluss durch (Abfall) zu sammeln. Nehmen Sie die Schüttelkolben aus dem Shaker und beginnen, den Überstand / Schlammgemisch auf die Säule zu übertragen, es wird die Ni-Harz erhalten und nur der Überstand wird durch fließen. Geben über das gesamte Volumen der Säule (7). </li><li> Mit 15 ml Waschpuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8) Waschen des Harzes 4x. Lassen Sie alle Waschpuffer Ablaufaus der Spalte und schließen Sie es mit der Kappe (untere Seite). </li><li> 2 ml Elutionspuffer (50 mM Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazol, pH 8) und lassen Sie sich für 5 min. Öffnen Spalte und sammeln das Eluat. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 mal (mit insgesamt 8 ml Elutionspuffer). Eluat, die hohe Konzentrationen von Protein enthält, zeigt typischerweise Schaum beim Schütteln (Abbildung 7). Halten Eluat auf nassem Eis, wann immer möglich. </li></ol></li><li> Pufferaustausch und Konzentration <ol><li> Prespin 15 ml Ultrafiltrationseinheiten Zentrifugation bei 3.000 × g bei 4 ° C für 20 Minuten (30 kDa cut-off für HA / NA, kann aber je nach dem gereinigten Protein der Größe variieren) mit PBS (pH 7,4-7,6). Verwerfen und durch Last Eluat fließen auf die Spin-Säule. Füllen Sie 5 ml sterilem, eiskaltem PBS und Spin für 60 min bei 3000 × g bei 4 ° C </li><li> Fördermenge durch wieder auffüllen mit 15 ml eiskaltem PBS und Spin für 60 min bei 3000 × g bei 4 ° C Wiederholen Sie diesen VerfahDure noch einmal. </li><li> Nehmen Sie die Spin-Säule aus der Zentrifuge und sammeln den Puffer ausgetauscht Konzentrat (typischerweise 200 ul). Dies ist hoch konzentriert rekombinanten Proteins. Mit 400 ul sterilem eiskaltem PBS spülen Spin-Säule und fügen Sie diese dem Konzentrat. Halten Sie das Konzentrat auf Eis zu allen Zeiten. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung und Qualitätskontrolle <ol><li> Messung der Proteinkonzentration Einen aliquoten des Konzentrats und messen, indem Sie Ihre Proteinquantifizierung Methode der Wahl. Eingestellt Proteinkonzentration auf 1 mg / ml durch Zugabe von PBS und gefrier kleinen Aliquoten bis -80 ° C Einfrieren und Auftauen schadet der Proteinstruktur und können, um die Aggregation führen. </li><li> SDS-PAGE und Coomassie-Färbung Führen Sie 500 ng Ihres Proteins auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Färbung durchführen. Für eine schnelle und bequeme Färbung verwenden Coomassie Reagenz in Kombination mit einer Mikrowelle Protokoll. HA-Proteine ​​bei 64 erscheinen in der RegelkDa wohin NA Proteine ​​sollten bei einer Größe von ca. 56 kDa (8A und B) durchgeführt. Mit dem beschriebenen Protokoll sollten Sie sehen keine Abbauprodukte. Wenn Abbau auftritt, ist es meist ein Zeichen von Hefe / Pilz-Kontamination während der Expression. In diesem Fall wiederholen Sie den Vorgang und stellen Sie sicher, alles steril zu halten. </li><li> Western-Blot / ELISA Um die Protein Identität zu überprüfen empfehlen wir tun, um eine Western-Blot-oder ELISA-Test mit einem spezifischen Antikörper. Idealerweise werden ELISA-Tests mit einem Antikörper, der an konformationelle Epitope (z. B. Anti-HA-Antikörper Stiel 1) bindet, durchgeführt. Unter Verwendung eines solchen Antikörpers kann die korrekte Faltung des Proteins bestätigt (Fig. 8C). </li><li> Mess NA-Aktivität Die korrekte Faltung des viralen NA kann auch durch Messen NA-Aktivität bestimmt werden. Wir empfehlen, diesen Test mit den im Handel erhältlichen NA * STAR-Assay (folgen Sie einfach den Benutzerrichtlinien) durchzuführen. </li></ol>

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	<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603 (2012).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., C&#225;rdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock,+ecuador.">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li><li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice.">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans.">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li><li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses.">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li><li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination.">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li><li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase.">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li><li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus.">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li><li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus.">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoplusia+ni+cells+(High+Five)+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles:+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines.">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li><li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+for+antibody+production:+evaluation+of+an+efficient+alternative.">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li><li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A/Brisbane/59/07+and+B/Florida/04/06+when+produced+in+various+protein+expression+systems.">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection.">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li><li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+(FluBlok)+against+influenza+in+healthy+adults:+a+randomized,+placebo-controlled+trial.">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li><li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase.">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li><li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells.">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+(H7N9)+Virus.">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li><li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin.">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses.">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza.">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li><li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+A+virus+(H7N7)+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome.">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li><li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Obwohl die Expression von Influenzavirus HA-und NA-Proteinen in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystem ist in der Regel geradlinig, gibt es einige wichtige Punkte zu beachten. Es ist wichtig, wie in der Einleitung erwähnt, dass die Ektodomäne von HA und NA werden in Fusion mit Trimerisierung oder Tetramerisierung Domänen exprimiert sind. Diese Bereiche gewährleisten eine korrekte Faltung der Moleküle in der Regel von der Transmembran-Domäne, die nicht vorhanden ist, wenn nur die Ektodom?...

Als eine erste Reaktion auf die jüngste Aufkommen der neuen H7N9 Influenzavirusstamm in China, haben wir Plasmide die genomischen Sequenzen für Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)-Gene der ersten zwei Isolate. Unter Verwendung dieser Plasmide waren wir in der Lage, schnell zu konstruieren Baculovirus-Expressionsvektoren zur Produktion von rekombinanten HA-und NA in Insektenzellen. Dieses Expressionssystem ist in unserem Labor etabliert und ist entscheidend für viele unserer laufenden Forschungsprojekte 8.1 bewiesen. Insektenzellen sind in der Lage, korrekt zu falten und post-translational komplexe Proteine ​​ändern. Diese Modifikationen umfassen N-verknüpften Glykosylierung, die für viele virale Glykoproteine ​​ist. Als solches ist es nicht verwunderlich, dass das Baculovirus-System exprimiert wird ganz für Influenzavirus-Oberflächenantigen hergestellt. In der Tat sind viele der HA-und NA-Kristallstrukturen unter Verwendung von Insektenzellen exprimierte Proteine ​​9-11 gelöst. Ein weiterer Vorteil derSystems liegt in seiner zuverlässigen hohen Protein-Ausbeuten von bis zu 30 mg HA / L Zellkultur (basierend auf unserer Erfahrung mit mehr als 50 verschiedene HA-Proteine) - eine Folge von Virus-Infektion Ausdruck angetrieben von der starken Polyhedrinpromotor. Entfernung der Transmembran-und Endodomäne der HA-und NA-Proteine ​​können für die Expression von sezernierbaren lösliche Versionen der Proteine ​​und somit das Reinigungsverfahren erheblich vereinfacht. Darüber hinaus sind diese Ektodomäne Hexahistidin markiert und kann daher unter Verwendung von Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni 2 +-Harz gereinigt werden. Die Transmembrandomänen von HA und NA-Proteine ​​tragen zu Homotrimer Homotetramer und Bildung auf. Um diese Oligomerisierungen bewahren, eine C-terminale Trimerisierungsdomäne fügen wir die HA-und ein N-terminales Tetramerisierungsdomäne zum NA konstruiert (Abb. 1). Wir haben eindeutig gezeigt, dass eine solche Trimerisierungsdomäne stabilisiert funktional, Folgenrved Konformationsepitope auf dem Halm-Domäne von HA 1. Die richtige Tetramerisierungsdomäne des NA könnte auch Falt-und NA-Funktion 10 zu korrigieren beitragen. Sequenzen und Baculo-Transfer-Vektoren, Trimerisierung oder Tetramerisierung Domains können von den Autoren oder von anderen Laboratorien auf dem Gebiet, 9,10,12 angefordert werden. Eine weitere wichtige Frage für die Expression von sezernierten Proteinen in Insektenzellen ist die Auswahl der richtigen Zelllinie. Während Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen abgeleitet unterstützen Baculovirus-Replikation sehr gut und werden im Allgemeinen für die Virusausbreitung und Rettungs verwendet, sie haben Kapazität, große Mengen an Protein zu sezernieren beschränkt. Trichoplusia ni gewonnen BTI-TN-5B1-4-Zellen (allgemein bekannt als High Five) eine höhere Kapazität und Sekretion sind die Zelllinie der Wahl, die für die Expression in diesem Protokoll 13,14. Darüber hinaus ist es hilfreich, zu reduzieren oder sogar beseitigen fötalem Rinderserum (FBS) von Expressionskulturen. Wir verwenden daher mit Medien reduziert (3%) FBS Inhalt für das Wachstum der Viren-Arbeits Aktien, und wir haben die Proteinexpression in Serum-freien Medien durchzuführen. Rekombinanten HA-und NA-Proteine ​​für viele immunologische Techniken verwendet. Vielleicht die häufigste ist in ELISA-Tests zur Messung der Serumkonversion bei der Impfung von Menschen oder Tieren 4,6,7,15. Aufweist und NA sind auch in ELISPOT Assays sowohl stimulierende Moleküle und Nachweisreagenzien für Antikörper sekretierende Zellen 16 verwendet. Ihre Verwendung als molekulare Köder ermöglicht, die speziell für Plasmablasten oder andere Arten von B-Zellen, die dann verwendet werden kann, um (therapeutische) monoklonalen Antikörpern (mAbs) zu isolieren, zu sortieren. Rekombinanten HA-und NA-Moleküle werden in der Charakterisierung dieser mAbs 8 verwendet. Weitere Beispiele sind die pH-Stabilität zu studieren oder Rezeptorspezifität wurde von anderen Virus-Isolate ausgedrückt, oder quantitativ Beurteilung spezifischer NA enzymatischeAktivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren. Außerdem rekombinante, gereinigte HA HA verwendet werden, um Inhalte von inaktivierten Influenza-Virus-Impfstoffen zu standardisieren. Wichtig ist, rHA (und zu einem gewissen Grad NA)-Impfstoff-Kandidaten werden derzeit in Tiermodellen und klinischen Studien am Menschen mit einem Impfstoff von der FDA im Jahr 2013 zugelassen 2,17-19 getestet. Der Vorteil dieser neuartigen Impfstoffen ist, dass aufgrund der Natur der rekombinanten Proteine, die arbeitsintensive Prozess der Erzeugung von hohen Wachstums reassortanten Viren vermieden werden. Vielleicht noch relevant ist die Tatsache, dass ihre Ausbeute an HA hohe und reproduzierbare von Stamm zu Stamm. Da diese Impfstoffe in einer Eierfreien System hergestellt, sie enthalten keine Proteinverunreinigungen, die problematisch für Menschen mit Allergien Ei sind. Hier haben wir uns für die HA-und NA-Proteine ​​aus zwei Isolate des neuen chinesischen H7N9 Influenza-Virus A / Anh ausdrückenui/1/13 und A/Shanghai/1/13 20,21. Das sind zeitnahe Beispiele, aber die beschriebene Protokoll kann zur Expression Influenza A-und B-HA-oder NA-Proteine ​​verwendet werden, und kann angepasst werden, um irgendwelche anderen sekretierten virale oder zelluläre Proteine ​​zu exprimieren. Trimeres oder tetrameres Transmembranproteine ​​können in die Expressionskassetten für HA und NA verwendet kloniert sind. Allerdings sind die meisten löslichen sekretierten zelluläre Proteine, wie Interferone, zum Beispiel nicht einen zusätzlichen Domänen zur Stabilisierung brauchen, und kann nur mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag ausgedrückt werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Expression von rekombinanten Proteinen. Hier verwenden wir es richtig gefaltet und glykosylierten Varianten des Influenza-A-Virus-Oberflächen Glykoproteinen produzieren - das Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Als Beispiel haben wir die HA-und NA-Proteinen durch das neuartige H7N9-Virus, das vor kurzem in China entstanden ausgedrückt. Jedoch kann das Protokoll leicht für HA-und NA-Proteine ​​von einem anderen Influenza A-und B-Virus-Stämmen exprimiert angepasst werden. Rekombinante HA (rHA) und NA (RNA)-Proteine ​​sind wichtige Reagenzien für immunologische Tests wie ELISA und ELISPOT und sind auch im breiten Einsatz für die Impfstoff-Standardisierung, Antikörper-Entdeckung, Isolierung und Charakterisierung. Darüber hinaus können rekombinante NA-Moleküle Bild für kleine Moleküle als Inhibitoren verwendet werden und sind nützlich für die Charakterisierung der enzymatischen Funktion der NA, sowie seiner Empfindlichkeit gegenüber antiviralen Mitteln. Rekombinanten HA-Proteine ​​sind auch being getestet experimentelle Vakzine in Tiermodellen, und ein Impfstoff auf Basis von rekombinanten HA wurde kürzlich von der FDA zur Verwendung bei Menschen zugelassen. Die Methode, die wir hier beschreiben, diese Moleküle zu erzeugen ist einfach und kann die Forschung in Labors Influenza zu erleichtern, da es für die Produktion von großen Mengen von Proteinen schnell und zu geringen Kosten. Obwohl hier konzentrieren wir uns auf Influenza-Virus Oberflächen-Glycoproteine, kann diese Methode auch verwendet werden, um andere virale und zelluläre Oberflächenproteine ​​zu produzieren.

HA-Moleküle aus A/Shanghai/1/13 und A/Anhui/1/13 gut mit Ausbeuten von etwa 20 mg / l Kultur ausgedrückt. NA-Moleküle beider Stämme zeigte moderate Expressionsniveaus im Bereich von 0,2 mg / l Kultur A/Shanghai/1/13 bis 0,7 mg / l für A/Anhui/1/13. Alle vier Proteinpräparate hatten sehr wenig bis gar keine Verunreinigungen (8A und B) mit HAS wobei der höhere Reinheit als NA, die durch die Expressionsniveau erklärt werden kann. A/Shanghai/1/13 HA wurde weiter mittels ELISA mit de...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine ​​exprimieren.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K Aufrufe.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Hier beschreiben wir einen Weg, korrekt gefaltete und funktionelle Influenza-Virus-Oberflächenantigene von den neuen chinesischen H7N9-Virus in Insektenzellen abgeleitet auszudrücken. Die Technik lässt sich an beliebigen Ektodomänen viraler oder zellulärer Oberflächenproteine ​​exprimieren. 

Serie: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem