Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt 2 GM061539 R15-02 (BAS), 2 NS40425 R15-03 (zu JEL), MH 66179 (Dr. Gary Banker der Oregon Health &amp; Science University / OHSU) und P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher von OHSU). Wir danken Barbara Smoody für umfangreiche Unterstützung mit der Kultur des Hippocampus-Neuronen und Drs. Brian Long und James Abney für eine kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten Sie einen DNA photoconvertible oder photoaktivierbares Chimäre gezielt auf dcvs, mit molekularbiologischen Standardtechniken codiert. Hinweis: Eine Möglichkeit ist, DNA, die für ein Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Dendra2 Chimäre (tPA-Dendra2). Dendra2 photoconvertible ist ein Protein, das von grün auf rot Emission bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht 12 schaltet. </li><li> Kultur Neuronen im Hippocampus auf Hochleistungs # 1.5 Deckgläser für ca. 5-10 Tage, nach Standardprotokollen 13. </li><li> Transfektion von Neuronen im Hippocampus entwickelt unter Verwendung eines kationischen Lipid-Reagenz. Hinweis: Viral-vermittelte Infektion ist effektiver für die reife Nervenzellen. Dieser alternative Ansatz wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben worden 14. <ol><li> Vorbereitung einer 1,5-ml-Röhrchen, enthaltend ~ 1 &amp;mgr; g DNA und 250 &amp;mgr; l von Minimal Essential Medium (MEM) und einem zweiten 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 4 &amp;mgr; l des kationischen Lipid-Reagens und 250 ulMEM. </li><li> Inkubieren der Lösung für 5 min. </li><li> Kombinieren der beiden Lösungen und Inkubieren der resultierenden Mischung für weitere 30 min. </li><li> Während der Inkubation, bereiten ein Gericht mit mehreren ml Kulturmedium erwärmt auf 37 ° C </li><li> Sanft übertragen Deckgläschen enthält Neuronen auf die Schale mit warmem Medium und fügen Sie die Transfektion Mischung. </li><li> Kippen Sie die Schale vorsichtig und dann legen Sie sie in einem Brutschrank bei 37 ° C für 90 min. </li><li> Zurück Neuronen, um ihre &quot;Heimatgericht&quot; und warten ~ 12-18 Stunden. </li></ol></li><li> Fix Zellen für 45 min in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) auf 37 ° C Hinweis: PALM-Experimente ist es wichtig, gute Erhaltung der Ultrastruktur zu erreichen, und Standard-Formaldehyd-Fixierung Protokolle für Immunfluoreszenzfärbung verwendet in der Regel nicht ausreichend 15. Ein wichtiger Grund für die schlechte Strukturerhaltung ist nicht ausreichend fixation, weil Formaldehydfixierung beinhaltet Adduktbildung und Proteinvernetzung, und das letztere Verfahren ist ziemlich langsam 16. Ein 45 min Fixierung hilft, dieses Problem ohne nachweisbare overfixation induzierten Fluoreszenzverlust zu mindern. </li><li> Wash Deckgläser ~ 10x mit gefiltertem PBS. Anmerkung: Dies reduziert fluoreszierende Verunreinigungen. Bild Proben relativ schnell nach der Fixierung. In den Zwischen, speichern Zellen bei 4 ° C in PBS gefiltert in einem lichtdichten Behälter. </li><li> Berg Deckgläschen enthält Neuronen in einer Kammer in PBS gefiltert. Hinweis: Die Probe ist in einem wässrigen Medium, wie PBS, mit einem Brechungsindex niedriger als der von Glas angebracht werden, um totale interne Reflexion (TIRF)-basierten Beleuchtungs implementieren. TIRF-basierte Beleuchtung ist sehr nützlich, da nur Deckglas-proximalen Fluorophore sind aufgeregt, und es gibt eine große verbundenen Rückgang der Hintergrundfluoreszenz 17. </li></ol> 2. Image Acquisition &lt;/ P&gt; <ol><li> Schalten Sie die Super-Resolution-Imaging-System. <ol><li> Einschalten des Bogenlampe. </li><li> Klappen Sie den &quot;System / pc&quot; und &quot;Komponente&quot; Schalter (an der Stromfernschalter) auf &quot;on&quot;. </li><li> Schalten Sie den Computer (nach dem Mikroskopsteuerung Tablette / Dockingstation kommt auf). Hinweis: Die Docking-Station kann verwendet werden, zu steuern und zu überwachen viele Attribute der Optik und Lichtpfad, insbesondere Wahl der objektiven und Fokus werden. </li><li> Doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, und wählen Sie die Option &quot;Start-System&quot; in der Login-Dialog. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie die Probe. <ol><li> Öffnen Sie die vordere und Top-Access-Panels auf dem Laserschutzgehäuse. </li><li> Neigen Sie den Durchlicht Arm auf die Bühne und Ziele zugreifen. </li><li> Setzen Öl auf der alpha Plan-Apochromat 100X numerische Apertur / NA = 1,46 (TIRF) Ziel. Hinweis: Ein 63X High-NA Ziel kann anstelle des 100X verwendet werden. </li><li> Montieren Sie die Probe auf der Bühne, und heben the Ziel in Richtung auf die Probe. </li><li> Überwachen Sie die Objektivposition mit der XYZ-Funktion der Dockingstation. Stoppen Sie, wenn die Linse im Baseballstadion von Fokus (zB z ~ 2,50 mm). </li><li> Komplett schließen Sie die Abdeckungen. Hinweis: Um die Lasersicherheit zu engagieren. </li><li> Feinabstimmung der Fokus mit den Okularen und Schaltflächen in der Registerkarte finden. Hinweis: Die lokalisieren Registerkarte bietet Zugriff auf Tasten, die Bogenlampe-basierte Beleuchtung produzieren und ermöglicht eine direkte Beobachtung der Probe mit den Okularen. Ebenso bietet die Registerkarte Akquisition Zugang zu Tools, die laserbasierte Beleuchtung erzeugen und erleichtert die Aufnahme von Bildern von der Kamera. <ol><li> Gehen Sie zur Registerkarte zu finden, wählen Sie &quot;Trans Am&quot;. </li><li> Klicken Sie auf das Augensymbol Expansion. Hinweis: Dies bringt eine schematische Darstellung des Lichtweges. Attribute des Lichtweges kann durch Linksklick entsprechenden Symbole im Schaltplan oder über den Touchscreen auf der Dockingstation geändert werden. Zum Beispiel kann ein Filterfür die Betrachtung von Emissions Dendra2 geeignet sind, können mit Hilfe der Reflektorrevolver Symbol gewählt werden. </li><li> Schauen Sie in die Okulare, und bringen die Zellen in den Fokus mit der Docking-Station als Leitfaden. Hinweis: Die Probe wird sehr dünn mit fluoreszierenden Zellen besiedelt, weil Neuronen im Hippocampus sind schwer zu transfizieren, und es kann somit ein wenig schwierig sein, mit Fokus reflektiert Beleuchtung. Wenn dies der Fall ist, benutzt der Durchlichtbeleuchtung und die z Lesen der Andockstation als Führung. </li><li> Schalten Sie das Licht &quot;Aus&quot; nach der Fokussierung. </li></ol></li></ol></li><li> Identifizieren Sie eine Zelle, die ziemlich hell ist, zeigt punktförmige Fluoreszenz und hat eine klassische Morphologie, die indikativ für eine gute Gesundheit ist. <ol><li> Wählen Sie reflektiert Licht und die entsprechenden Filter für die Anzeige grüne Emission Dendra2. </li><li> Scannen Sie das Deckglas für Zellen, die Dendra2 Chimären mit geringer Intensität Anregungslicht. </li></ol></li><li> Wechseln Sie auf die ACQuisition Registerkarte. <ol><li> Mit der &quot;Experiment-Manager&quot;, um eine PALM Erwerb Konfiguration, die richtig konzipiert wird oder leicht modifiziert zu laden. Hinweis: Wenn kein solches Experiment besteht, die Gestaltung eines experimentellen Startkonfiguration mit den folgenden Einstellungen als Leitfaden: Laserleistung Schieber: 405 nm (~ 0,01% für eine 50-mW-Laser); 488 nm (~ 3% für eine 100-mW-Laser); 561 nm (~ 40% für eine 100-mW-Laser); Belichtungszeit: ~ 50 msec; Camera gain: ~ 200; Mehrdimensionale Erfassung: Zeitreihen (= 30.000 Zyklen, Intervall = 0); Tracks: 488 nm mit epi-Beleuchtung, und 561 nm mit TIRF-basierte Beleuchtung (siehe Schritt 2.5.1); Ziel: 100X (NA = 1,46); TIRF-Winkel-Schieberegler: Einfallswinkel ~ 67-72 °; Pixelgröße: 100 nm; Sehfeld: TIRF (die alternative Wahlmöglichkeiten ergeben höhere Laserintensitäten und sind für Fluorophore, die schwieriger zu bleichen verwendet werden). </li><li> Klicken Sie &quot;Ja&quot;, wenn ein Pop-up-Menü mit einer Abfrage über die Umstellung auf Laser. </li></ol></li><li> Bringen Sie die Bildder Zelle in den Fokus an der Kameraebene. <ol><li> Wählen Sie die 488-nm-Laser-Auflicht-Strecke. Hinweis: Tracks sind Strahlkonfigurationen während der Bildgebung verwendet. Hier werden Track-Namen von der Anregungswellenlänge, die die Emission, die an die Kamera übergeben wird, produziert bestimmt. Zum Beispiel verwendet die 561 nm sowohl die Spur 405 und 561 nm Laserlinien, aber der Filterwürfel passiert nur Emission photokonvertiertem Dendra2 von 561 nm-Licht auf die Kamera angeregt. </li><li> Stellen Sie das Bild von der Zelle auf der Kamera mit dem &quot;kontinuierlich&quot; Nahme-Taste. </li></ol></li><li> Sammeln Sie eine herkömmliche Bildweitfeld. <ol><li> Mit der Schaltfläche &quot;Snap&quot;. </li><li> Speichern Sie das Bild, indem Sie auf das Menü &quot;Datei&quot; und wählen Sie &quot;Speichern / Speichern unter.&quot; </li></ol></li><li> Richten Sie die TIRF-basierte Beleuchtung. <ol><li> Wählen Sie die Spur 488 und wechseln Sie mit der EPI / TIRF Schaltfläche &quot;TIRF&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;kontinuierlich&quot; Akquisition. </li><li> Stellen ter TIRF-basierte Beleuchtungsregler. Hinweis: TIRF wird erreicht, wenn es eine plötzliche Verdunkelung der Hintergrund und die Probe in einer Ebene 18 fokussiert werden. Wenn neue Funktionen werden durch eine Fokussierung bis in die Probe hervorgeht, ist der Einfallswinkel zu niedrig, weil in TIRF gibt es nur eine Ebene des Fokus. </li><li> Überprüfen Sie die TIRF-Winkel mit der 561 Track mit dem 405-nm-Laser &quot;off&quot;. </li><li> Schalten Sie die 405-nm-Laser zurück &quot;on&quot;, bevor sie eine PALM Experiment. </li></ol></li><li> PALM sammeln Daten. <ol><li> Hit &quot;Start-Experiment.&quot; Hinweis: Wenn gewünscht, öffnen Sie die Registerkarte &quot;Online-Verarbeitungsoptionen&quot; und aktivieren Sie &quot;Online-Verarbeitung PALM&quot; und &quot;Fit Gauss2D&quot; (vor Beginn des Experiments), das rekonstruierte Bild PALM während Rohdatenerhebung überwachen. Dadurch wird die Bewertung der Qualität der Daten und somit der Wert der Fortsetzung der relativ zeitaufwendige Datenerfassungsprozess zu erleichtern. </li><li> VisuellPhoto überwachen. </li><li> Erhöhen Sie die Intensität der 405 nm (photoconverting)-Laser, wenn Dendra2 Photo abnimmt (in der Regel nach dem Erwerb von ~ 10.000 RAW-Bilder). </li><li> Weiter, wenn das Experiment Photo steigt. Andernfalls stoppen Sie den Versuch (ohne Datenverlust) durch das Drücken der &quot;Stopp&quot;-Taste aktuellen Schritt. </li><li> Speichern Sie die Bilder, wenn die Datenerhebung ist (nach ~ 15 min) abgeschlossen. </li></ol></li></ol> 3. Bildverarbeitung, Display und Analyse <ol><li> In Abwesenheit von Online-Verarbeitung, Prozess-RAW-Bilder, die auf der Festplatte gespeichert wurden. <ol><li> Klicken Sie auf der Registerkarte Verarbeitung, öffnen Sie die Registerkarte Verfahren, und wählen Sie &quot;PALM&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;PALM&quot; wieder aus den vier Unteroptionen. </li><li> Gehen Sie auf die Datei-Menü, öffnen und die Datei von Interesse ist, und drücken Sie &quot;wählen.&quot; </li><li> Hit &quot;anzuwenden.&quot; Hinweis: Damit werden Spitzen / Fluorophor Feststellung und Lokalisierung mit Spitzenmäßig opti initiierenons. Wenn nötig, Spitzen können auch über die Registerkarte &quot;PAL-Group&quot; zusammengefasst werden. Gruppierung weist Spitzen, die in mehreren aufeinanderfolgenden Frames scheinen einem einzigen Molekül, wenn die Spitzen Koordinaten ausreichend ähnlich sind. Darüber hinaus können die Daten für die Probendrift modellbasierte Option der Software Ausrichtungsdrift korrigiert werden. </li></ol></li><li> Filtern Sie schlecht lokalisiert und schlecht abgetastet Komponenten in den Spitzen lokalisierten Daten. <ol><li> Entsorgen Fluorophore mit Lokalisierung Genauigkeiten, σ,&gt; 35 nm mit dem &quot;PAL-Filter&quot;-Tool. </li><li> Verwerfen Fluorophoren in Gebiete, in denen der mittlere Abstand zwischen den Spitzen, d, ist zu groß, um Vesikel mit einem Durchmesser, D. beheben <ol><li> Entpacken Sie die mittlere Lokalisierungsgenauigkeit, σ, aus der Lokalisierungsgenauigkeit Histogramm. </li><li> Berechnen Sie einen maximal zulässigen Wert für d basierend auf σ, und der Shannon-Nyquist criteron 19, wie in der Resolution Näherung 20 R verkörpert = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Stellen Sie die Schwelle in der &quot;Entfernen PALM Ausreißer&quot; Werkzeugspitzen von weniger als &amp;pgr; D 2 / (4d 2) umgeben löschen Nachbarn innerhalb eines Kreises mit dem Radius D / 2. </li></ol></li><li> Die verarbeitete PALM Konvertieren von Daten in ein Bild mit dem PALM &quot;PAL-Rendering&quot;-Werkzeug; siehe Abbildung 1. </li><li> Quantifizieren Größen und Trennungen, indem Sie die Funktion &quot;Profil&quot;. <ol><li> Überprüfen Sie die zugehörigen Leitungs und Tabellenoptionen, und ziehen Sie eine Linie entlang der gewünschten Richtung im Bild. </li><li> Quantifizieren Durchmessern durch die Bestimmung volle Breite bei halber maximaler Intensität. </li><li> Quantifizieren Trennungen durch die Bestimmung Spitze-zu-Spitze-Abstände der Intensitätsprofile. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

PALM und verwandten Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken haben vor kurzem entstanden als eine wertvolle Ergänzung zum besser etablierten Formen der optischen Mikroskopie und Elektronenmikroskopie (EM) 22-24. Positive Attribute PALM sind relativ einfache Probenvorbereitung und minimale Proben Störung. Grundsätzlich PALM auch verwendet werden, um lebende Zellen zu untersuchen. Wahrscheinlich der Haupt negatives Attribut von PALM ist zeitaufwendig Datenerfassung, die erheblich behindert Studien ...

Eine Reihe von zellulären Prozessen abhängig von genauen und effizienten Vesikel vermittelten Handel von Biomolekülen an spezifischen subzellulären Destinationen. Ein prominentes Beispiel ist die synaptische Versammlung, die durch langfris reichten, Vesikel-vermittelte Abgabe der synaptischen Bestandteile von Seiten der Biogenese der neuronalen Soma potenziell distalen prä-und postsynaptischen Websites 1 vorangestellt ist. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke und beliebte Methode der Untersuchung Vesikeltransport. Stärken der Methode sind seine Sensitivität, Spezifität und die Kompatibilität mit Live-Bildgebung 2. Leider bis vor kurzem die Technik von einer großen Schwäche, beugungsbegrenzten Auflösung 2, die Untersuchungen von Strukturen mit Abmessungen kleiner als ~ 250 nm behindert gelitten. Kürzlich laterale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie übertraf die Beugungsgrenze mit der Einführung der Super-Resolution-Fluoreszenz miMikroskopie-Techniken, wie PALM 3. Die laterale Auflösung von PALM, zehn Nanometern, ist ideal, um das Studium der Vesikel, die Dimensionen, die typischerweise im Bereich von 50 bis 250 nm ~ 4 haben geeignet. So ist es nun möglich, Fluoreszenz zu verwenden, mit seinen unzähligen Stärken, um ein Spektrum von bisher unzugänglichen Attribute von Vesikeln, darunter auch einige Aspekte ihrer Handel auf bestimmte Websites subzellulärer aufzuklären. PALM ist nicht einfach zu implementieren und erfolgreichsten Strategien müssen oft von der Art des untersuchten Systems zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir, wie man PALM Studien von vesikulären Strukturen zu implementieren, und wir zeigen die Wirksamkeit unseres Ansatzes für den Fall der dcvs in Hippocampus-Neuronen. Insbesondere verwenden wir PALM zu der Hypothese, dass der Menschenhandel zu dcvs Synapsen im Hippocampus-Neuronen-Adresse wird von DCV Cluster 8.5 vermittelt. Cluster-vermittelte Handel Vesikel an Synapsen in Entwicklungs neurons ist eine faszinierende Möglichkeit, weil es schnelle synaptische Stabilisierung und Montage 9,10 erleichtern. Die Befürworter der Clusterhandel dcvs zitieren die große scheinbare Größe extrasynaptische Fluoreszenz puncta beherbergen exogene DCV Fracht, wie Nachweise für Clustering-6. Allerdings erscheinen diese puncta in Bildern erzeugt unter Verwendung von beugungsbegrenzten Fluoreszenzmikroskopie-Techniken, die nicht zu unterscheidende Größe Wirkungen, die sich aus der Beugung von denen aus Clustering geeignet sind. Um dieses Problem zu beheben, haben wir für konventionellen Weitfeld-Fluoreszenz und PALM Bilder von Hippocampus-Neuronen, Chimären zu dcvs richtet. Die Analyse dieser Bilder ergab, dass&gt; 92% der vermeintlichen extrasynaptische DCV-Cluster in konventionellen Bildern als 80 nm (Einzel DCV-Größe) 11 puncta in PALM Bildern behoben. Somit sind diese Daten weitgehend zum Erlöschen der Clustering-Hypothese über dcvs in Entwicklungs hippoca angewendetMPAL Neuronen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> Detektion von Fluoreszenz ist die Grundlage für viele weithin genutzt und rasch fort Mikroskopie-Techniken in der modernen biologischen und medizinischen Anwendungen eingesetzt. Stärken der Fluoreszenz sind seine Sensitivität, Spezifität und die Kompatibilität mit Live-Bildgebung. Leider konventionellen Formen der Fluoreszenzmikroskopie leiden an einer großen Schwäche, beugungsbegrenzten Auflösung in der Bildebene, die Untersuchungen von Strukturen mit Abmessungen kleiner als ~ 250 nm behindert. Vor kurzem hat diese Einschränkung mit der Einführung der Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie Techniken, wie photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) überwunden. Anders als ihre konventionellen Pendants, können PALM Bilder mit einer lateralen Auflösung von zehn Nanometern zu erzeugen. So ist es nun möglich, Fluoreszenz zu verwenden, mit seinen unzähligen Stärken, um ein Spektrum von bisher unzugänglichen Attribute der zellulären Struktur und Organisation aufzuklären. _content &quot;&gt; Leider ist PALM nicht trivial zu implementieren und erfolgreiche Strategien müssen oft auf die Art des untersuchten Systems angepasst werden. In diesem Artikel zeigen wir, wie einfarbige PALM Studien von vesikulären Strukturen in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. PALM ist ideal, um das Studium der Vesikel, die Dimensionen, die typischerweise im Bereich von ~ 50-250 nm. Schlüsselschritte in unserem Ansatz enthalten haben geeignet Kennzeichnung Neuronen mit photoconvertible (grün bis rot) Chimären Vesikel Fracht, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer Super-Resolution-Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, um eine hochauflösende Bild PALM produzieren. Wir haben auch die Wirksamkeit unseres Ansatzes zu demonstrieren indem außergewöhnlich gut aufgelöste Bilder der Dense-Core-Vesikel (dcvs) in kultivierten Hippocampus-Neuronen, die zu widerlegen die Hypothese, dass extrasynaptische Handel dcvs wird weitgehend von DCV-Cluster vermittelt.

Figur 1 zeigt ein Endprodukt Fassung und-verarbeitung. In diesem Bild PALM sind seitliche Koordinaten lokalisiert Fluorophore mit den Schwerpunkt-Anzeigemodus dargestellt, und der Super-Resolution-Bild der zugehörigen DCV wird mit dem Gauß-Display-Modus angezeigt. 2A zeigt analog Weitfeld und PALM Bilder der Soma und proximalen Prozesse eines 8 Tage in vitro Hippocampus-Neuronen exprimieren tPA-Dendra2. Wichtige Merkmale der Bilder sind die (1...

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K Aufrufe.  Lewis & Clark College.  Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen. 

Serie: Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

Quantitative Ansätze für scoring in vivo Neuronal Aggregate und Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.