Name: in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
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This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1. Gesamtpigmentextraktion aus Spinatblättern <ol><li> Homogenisieren eine Handvoll Blattspinat (~ 20 g) in 100 ml kaltem Grinding-Puffer (siehe Tabelle 1) mit einem Mixer für 20 Sekunden. </li><li> Filtern der Lösung durch ein zwei Schichten aus Nylongewebe mit einem Porendurchmesser von 20 um und Zentrifuge das Filtrat bei 1500 g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Das Pellet, das die Chloroplasten mit einem weichen Pinsel Künstler malen in 1 ml kaltem Waschpuffer (siehe Tabelle 1). Sobald das Pellet resuspendiert, mit 50 ml Waschpuffer und Zentrifuge die Lösung bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet vorsichtig (Thylakoide) in 50 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 1). </li><li> Zentrifugieren der Lösung bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C vollständig zu entfernen, den Überstand. An dieser Stelle führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit, um Pigment Oxidation zu vermeiden. </li&gt; <li> Fügen ~ 20 ml 80% Aceton mit Na 2 CO 3 gepuffert (siehe Tabelle 1), um die Pigmente zu extrahieren. Verlassen Sie die Lösung auf Eis für 10 min, gelegentlich Vortexen. </li><li> Pellet die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. HINWEIS: Wenn die Pigmente nicht völlig extrahiert, wird der Pellet eine grüne Farbe haben und Schritt 1.6 sollte wiederholt werden. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit in einen Scheidetrichter. Fügen 0,4 Volumina Diethylether, kräftig schütteln und öffnen Sie das Ventil, um das Gas zu entlüften. </li><li> Fügen 0,8 Volumen von 0,33 M NaCl und kräftig mischen. ~ 10 min ermöglichen die Schichten zu trennen. Die Ether-Phase auf die extrahierten Pigmente enthält. Entfernen Sie die untere Phase. HINWEIS: Wenn die Trennung nicht klar ist, einfrieren und auftauen die Lösung, um die Phasentrennung zu verbessern. </li><li> Entfernen Sie den Äther durch Eingießen von der Oberseite der Scheidetrichter in einen geeigneten Glasbehälter. Trocken, indem Sie einen Löffel grandere wasserfreiem Natriumsulfat. Schwenken Sie die Lösung und lassen ~ 5 min für das Trockenmittel, um Wasser aus dem Äther zu absorbieren. HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Natriumsulfat erscheint völlig verklumpten; Es sollte auch frei schwebend sein, wenn die Kristalle Ether ausreichend getrocknet. Wenn eine Wasserschicht bildet, entfernen Sie diese mit einer Pasteur-Pipette, bevor zusätzliche wasserfreiem Natriumsulfat. </li><li> Dekantieren den Äther zu einem neuen Glas-Container, so dass das Natriumsulfat solide hinter sich. </li><li> Verdampft den Ether im Rotations Speedvac oder unter einem Strom von N 2. </li><li> Man löst die Pigmente vollständig in 10 ml 100% igem Aceton gewaschen. </li><li> Verdünnte eine kleine Menge (~ 3 ul) in 1 ml 80% Aceton und Messen der Absorptionsspektren und bestimmen den Chl a / b-Verhältnis und die Chl-Konzentration mit der durch Porra et al. (1989) 15. </li><li> Aliquoten und trocknen die Pigmente in einem Dreh Speedvac oder unter N 2-Strom, bis das Aceton istvollständig verdampft ist. Bewahren Sie die getrockneten Pigmente bei -80 ° C. </li></ol> 2. Extraktion der Carotinoide aus Spinat <ol><li> Führen Sie die Schritte 1.1 bis 1.5. An dieser Stelle führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit, um Pigment Oxidation zu vermeiden. </li><li> Resuspendieren thylakoid Pellet in ~ 50 ml 96% Ethanol mit Na 2 CO 3 (siehe Tabelle 1) zwischengespeichert, um die Pigmente zu extrahieren. Verlassen Sie die Lösung auf Eis für 5 min. </li><li> Pellet die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. HINWEIS: Wenn die Pigmente nicht völlig extrahiert, wird der Pellet eine grüne Farbe haben und Schritt 2.2 sollte wiederholt werden. </li><li> Sammeln des Überstandes und mit 0,1 Volumen von 80% KOH (w / v) einer Verseifung initiieren. </li><li> Verlassen Sie die Lösung bei 4 ° CO / N, fest verschlossen und vor Licht geschützt. </li><li> Sammeln Sie die Lösung in einen Scheidetrichter. 1 Volumen Diethylether und vorsichtig mischen. </li><li> 0,8 vol hinzufügenmengen von 0,33 M NaCl und vorsichtig mischen. ~ 10 min ermöglichen die Schichten zu trennen. Die orange Ether-Phase auf verseiften enthält die Carotinoide. Entfernen Sie die grüne untere Phase durch Ablassen durch den Hahn des Trichters. </li><li> Hinzufügen 3 Volumen Wasser und vorsichtig mischen, um das Kaliumhydroxid zu entfernen. Lassen Sie die Schichten zu trennen. HINWEIS: Wenn die obere Phase trübe erscheint, fügen Sie eine kleine Menge von NaCl (zB 3 g NaCl in 200 ml Lösung) und vorsichtig schwenken, sich aufzulösen. </li><li> Entfernen Sie die untere Phase durch Ablassen durch den Hahn des Trichters. </li><li> Folgen Sie den Schritten von 1,10 bis 1,13. </li><li> Verdünnte eine kleine Menge (~ 3 ul) in 1 ml 80% Aceton und Messen der Absorptionsspektren bei 440 nm in 80% Aceton. Um die Konzentration zu bestimmen, verwenden Sie die Durchschnittskoeffizient Aussterben der Carotinoide (ε 440 = 255) 16 in der folgenden Formel: Auto [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (Strahlengang) = 1 cm. </li><li> Aliquoten und trocknen Sie die carotenoids in einem Speedvac oder unter N 2-Strom, bis alle Diethylether wurde verdampft. Bewahren Sie die getrockneten Pigmente bei -80 ° C. </li></ol> 3. Gesamt Pigment und Carotinoid-Extraktion aus Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Wachsen C. reinhardtii auf festen TAP Medium 17 in einer Petrischale durch die Verbreitung eine kleine Menge Flüssigkultur auf die Oberfläche. Wachsen unter ständiger Beleuchtung Strom von 20 mmol Fotos PSA m -2 s -1 bis eine grüne Schicht von Zellen sichtbar ist. </li><li> Verwendung einer sterilen Impföse ernten eine kleine Menge von C reinhardtii vom festen TAP Medium und setzen Sie die Zellen in 500 ml Leitungsmedium 17 in einem 1 l-Kolben. Die Kultur bei 25 ° C mit 170 Upm unter Rühren unter kontinuierlicher Beleuchtung Fluß von 20 umol Fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Nach 5-6 Tagen ist die Kultur am Ende der logarithmischen Phase erreicht (6 x 10 6 Zellen / mloder 2-2,5 optische Dichte bei 750 nm). Zentrifugieren der Kultur bei 4000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> Für Gesamtpigment-Extraktion, befolgen Sie die Schritte 1,6 bis 1,15. </li><li> Die Ausbeute an Gesamtpigmentextrakt ab 500 ml Vollwachstumskultur von C. reinhardtii ist etwa 5 ml Lösung mit einer Konzentration von 0,5 mg Chl a + b / ml. </li><li> Carotinoide für Extraktion, befolgen Sie die Schritte 2,2 bis 2,12. </li></ol> 4. Reinigung von Inclusion Bodies <ol><li> Klonierung der kodierenden Sequenz des LHC Protein von Interesse in einen Expressionsvektor, der in einem kondensierten C-terminalen His-Tag unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren ergibt. Verwandeln, die dieses Konstrukt in E. coli-Wirtsstamm wie BL21 (DE3). </li><li> Vorbereitung Lysepuffer, Wasch-Puffer, Triton-Puffer TE (Tabelle 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und LB-Medium 18 mit den entsprechenden Antibiotika. </li><li> Wählen Sie eine einzE E. coli-Kolonie, enthaltend den Expressions Klon aus einer frisch ausgestrichenen Platte in ~ 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika unter Verwendung von Standardverfahren 6. Wachsen bei 37 ° C mit 220 Upm Rühren für mindestens 16 Stunden. </li><li> Hinzufügen von 2,5 ml des O / N-Kultur in einen 1 l-Erlenmeyerkolben mit 250 ml LB mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. </li><li> Wachsen die Zellen für 2-3 Stunden (oder bis die OD 600 ~ 0,6) bei 37 ° C bei 220 UpM. </li><li> Hinzufügen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C mit 220 Upm 3-4 h wachsen. </li><li> Zentrifugieren der Kultur für 10 min bei 5.000 × g bei 4 ° C in einem vorgewogenen Zentrifugenglas. Überstand verwerfen und gründlich Bestimmen Sie das Gewicht des Pellets durch Wiegen wieder und Subtraktion der Zentrifugenröhrchen Gewicht. </li><li> Resuspendieren E. coli-Zellpellet in 0,8 ml / g Lysepuffer durch kräftiges Vortexen. HINWEIS: Alternativ kann das Zellpellet bei -80 eingefrorenC für die spätere Verwendung. Wenn die mit einem gefrorenen Pellets, lassen Sie sie vollständig vor der Zugabe des Lyse-Puffer auftauen. </li><li> Add 2 mg Lysozym pro Gramm Zellen und Inkubation auf nassem Eis mit gelegentlichem Vortexen für 30 min. </li><li> Mit 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 ug / ml RNAse. Wirbel und auf Eis für 30 Minuten setzen. </li><li> 2 ml kaltem Detergenspuffer pro Gramm Zellen. Gut mischen und halten RT für 5 min. </li><li> Übertragung auf 2 ml Zentrifugenröhrchen (aufgeteilt in zwei Röhren, wenn nötig). Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> 1 ml kaltem Triton-Puffer und die Pellets durch Sonifikation (3 x 5 sec Impulse x 50% Leistung mit 20 Sekunden-Intervallen) vollständig zu suspendieren. HINWEIS: Haben Sie den Schlauch in einem kleinen Becherglas mit Eis Wasser umgeben, um sie während der Sonifikation kalt zu halten. Im Falle von Mehrfachrohren, verbinden die resuspendiert Einschlußkörper in eine Röhre nach Resuspendierung. </li><li> Zentrifugieren für 10 min bei 12.000× g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.13 und 4.14 zwei Mal. </li><li> Resuspendieren der Einschlusskörper in 1 ml kaltem TE mit Sonifikation für einen letzten Wasch die Triton-Puffer zu entfernen. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> Das Pellet in 1 ml kaltem TE durch Beschallung. </li><li> Beurteilung der Proteinkonzentration durch Standardverfahren, wie dem Bradford-Assay 19. Speicher Aliquots der Einschlusskörper bei -20 ° C. </li></ol> 5. Rekonstitution Dieses Protokoll liefert typischerweise 1-2 ml der rekonstituierten Protein mit einem Außendurchmesser von 4, wenn die Absorption in der Region Qy (600-750 nm) gemessen. Menge kann nach Wunsch eingestellt werden, wobei darauf zu achten ist, um die richtigen Verhältnisse während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: 2x Rekonstitutionspuffer, 20% OG, 2 M KCl, TE. Führen Sie das folgende sTEPs bei schwachem Licht. </li><li> Resuspendieren 800 ug LHC Inclusion Bodies in insgesamt 400 ul TE in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 400 ul der 2x Rekonstitutionspuffer und kurz vortexen. </li><li> Fügen 0,6 ul β-Mercaptoethanol (14,8 M stock), um eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten. Wärme, die das Protein für 1 min bei 98 ° C aufweist. Wirbel kurz und Ort bei RT für 3 min. </li><li> Resuspendieren 500 g Gesamt-Chlorophyll-Pigmente getrocknet plus 80 ug Carotinoidpigmente in 30 ul 100% EtOH durch kräftiges Vortexen für 1 min oder in einem Ultraschallbad für 1-2 min. </li><li> Drehen Sie das Pigment-Mix ~ 30 sec bei 15.800 xg bei 4 ° C und bestätigen, dass es keine Pellets. Wenn es ein Pellet, wiederholen Verwirbelung und / oder Ultraschallbehandlung. WICHTIG: Nach der Aufwirbelung und Spin, sofort Pigment in den das Protein, oder es kann zu aggregieren und müssen wieder suspendiert werden. </li><li> Langsam das Pigment-Mix zu dem gekühlten Protein unter Vortexen. Weiterhin Wirbel 5-10 sec und das Röhrchen auf nassem Eis. Seien Sie vorsichtig, nicht zu kräftig vortexen, wie das Protein die Spitze des Rohres überlaufen. </li><li> Fügen Sie 94 ul 20% Octyl β-D-glucopyranosid (OG) (Endkonzentration 2%), kurz vortexen und auf Eis 10 min halten. </li><li> Fügen Sie 90 ul von KCl 2 M (Endkonzentration 150-200 mM), kurz vortexen und auf Eis 20 min halten. HINWEIS: Säulenvorbereitung (Abschnitt 6) kann zu diesem Zeitpunkt eingeleitet werden. </li><li> Spin für 10 min bei 15.800 × g bei 4 ° C ist. Überstand entfernen, ohne das Pellet (gefälltes LDS) in einen 10-ml-Röhrchen stören. Halten Kälte und vor Licht geschützt. </li></ol> 6. Nickel Säulenreinigung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: OG-Puffer, OG Spülpuffer, Elution Puffer. </li><li> Verbinden einer Ni-Sepharose-Säule (1 ml) oder äquivalent zu einer Schlauchpumpe gewährleistet, dass keine Luft in der Säule wird bei diesem Schritt und die nachfolgenden Schritte. </li><li> Stellen Sie die Geschwindigkeit von ter zu pumpen, um 1 ml / min und spülen Sie die Säule mit 5-10 ml Wasser, um die Storage-Lösung zu entfernen. </li><li> Ins Gleichgewicht der Säule mit 3-4 ml OG-Puffer. </li><li> Zusatz von 3-4 ml OG-Puffer zu der Proteinprobe und der Last auf die Säule. Hinweis: Wenn das Protein wurde auf Eis nach der Entfernung des LDS sitzen länger als 10 min, wieder drehen sich mit 15.800 g bei 4 ° C für 1 min, um zusätzliche LDS Niederschlag zu entfernen. </li><li> Spülen der Säule mit 5 ml OG-Puffer. </li><li> Mit 2 ml OG Spülpuffer Spülen der Säule. </li><li> Elution des gebundenen Proteins mit 3 ml Elutionspuffer. Sammeln Sie die grüne Eluat, das die wiederhergestellten Protein enthält. Hinweis: Dies ist in der Regel etwa 1 ml insgesamt. </li></ol> 7. Saccharosegradientenzentrifugation <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: Saccharose-Lösung, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6. </li><li> Füllen Ultrazentrifuge Rohre mit der Saccharose-Lösung und bei -20 ° CO / N or -80 ° C für mindestens 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch aus dem Gefrierschrank und lassen Sie bei 4 ° C auftauen ungestört. HINWEIS: Die Frost / Tau-Verfahren erzeugt einen Gradienten von 0,1 bis 1 M Saccharose. Eine 15-ml-Tube taut in der Regel in etwa 3 Stunden. </li><li> Sorgfältig von oben zu entfernen das gleiche Volumen wie die grüne Fraktion aus der Nickel-Sepharose-Säule in Schritt 6.8 eluiert. Dann laden Sie die rekonstituierte Probe langsam auf, um zu vermeiden das Gefälle zu stören. </li><li> Balance Rohren und Spin bei 200.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge mit einem SW-41 oder SW-60 Ausschwingrotor für 18 Stunden, eingestellt, um die Beschleunigung und Stoppen ohne Bremsen verlangsamen. </li><li> Sie vorsichtig die Gradienten von der Rohrhalter mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine Spritze mit langer Nadel, die eine stumpfe Öffnung, um den Anteil von der Spitze zu sammeln hat. HINWEIS: Alternativ sammeln Fraktionen von unten durch Anstechen des Röhrchens mit einer Nadel und Sammeln Tropfen. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Membranproteine ​​sind nicht so leicht zu untersuchen. Isolierung von nativen Membranproteine ​​wird durch die Notwendigkeit, die Lipid-Doppelschicht mit Detergenzien solubilisieren, die das Protein beschädigen und zu entfernen wesentlichen Kofaktoren kompliziert. Diese Proteine ​​können auch in geringen Mengen vorhanden sein, die in biologischen Membranen oder mit eng verwandten Proteinen gemischt werden, wie im Fall der Lichtsammelkomplexe, die die Reinigung der einzelnen Komplexe erschwert. Heterologe Proteinexpression in E. coli und in vitro Rekonstitution bietet die Möglichkeit, diese Probleme zu vermeiden. In vitro Rekonstitution und Reinigung von gefalteten Proteinen führt zu Komplexen, die Eigenschaften sehr ähnlich denen des nativen Komplexe 20,21,23 und besitzen somit verwendet werden, um Komplexe, die nicht bis zur Homogenität gereinigt werden können, 24 zu untersuchen - 27. Dieses Verfahren verwendet Spinat, die leicht ist attainable ganze Jahr über, als Quelle für den Gesamtpigment und Carotinoid-Zubereitungen. Für einige Rekonstruktionen von Proteinen stammt aus Algen ist die Verwendung von Pigmenten aus Algen gereinigt aufgrund unterschiedlicher Pigmentzusammensetzungen bevorzugt. Das Chl a / b-Verhältnis und Chl / Auto Verhältnis gleich bleibt, unabhängig von Pigmentquelle. Es ist wichtig zu erkennen, dass der Wirkungsgrad der Rekonstitution ist in der Regel rund 35% 28. Somit ist es erforderlich, die nicht-gebundene Pigmente und das entfaltete Apoprotein aus der Lösung nach dem Auflösen zu entfernen. Ein Zwei-Schritt-Reinigungsprotokoll wird in diesem Protokoll vorgestellt (siehe Ergebnisse). Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Saccharose-Gradienten Schritt nicht die vollständige Trennung der Apo-und Holo-Protein zu ermöglichen. Bei den meisten Analysen ist dies kein Problem, da das Apoprotein keine Pigmente enthalten und somit nicht mit den funktionellen Messungen stören. In dem Fall ist es jedoch notwendig, die Apoprotein vollständig entfernen aus der FRAktion mit dem rekonstituierten Komplexes (zum Beispiel, um das Pigment zu Protein-Stöchiometrie berechnen), kann eine anionische Austauschsäule verwendet werden (siehe Passarini et al. 2009 29 für Details). Die Fähigkeit zur rekombinanten Lichtsammelproteine ​​mit isolierten Pigmente in vitro Rückfaltung bietet die Möglichkeit, &quot;manipulieren&quot; die Komplexe durch Änderung der Rekonstitution &quot;Umwelt&quot; in verschiedener Weise, wodurch sich die Eigenschaften des resultierenden Komplexes. Zum Beispiel kann die Änderung der Pigmentzusammensetzung bei der Rekonstitution in einem Komplex mit veränderten Pigmentzusammensetzung führen. Diese Funktion kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Pigmente auf der Struktur und Stabilität des Komplexes zu untersuchen. Regel die Pigmentzubereitung aus Spinat erhalten wird, eine Chl a / b-Verhältnis von 3: 1 und einen Chl / Auto-Verhältnis von 2,9: 1 liegt. Dieses Verhältnis typischerweise eine rekonstituierte Protein mit den gleichen Eigenschaften wie der nAtive einem. 33 - jedoch kann die Einstellung der Chl a / b-Verhältnis durch Zugabe von gereinigtem Chl a oder b die Bindung von verschiedenen Pigmenten aufgrund der unterschiedlichen Selektivität der Bindungsstellen 30 zu beeinflussen. Dies ist möglich, weil die meisten der Pigmentbindungsstellen sind nicht vollständig selektiv für Chl a und Chl b, kann aber auch unterzubringen, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität 10,30,34. In ähnlicher Weise wurden die Carotinoid-Bindungsstellen auch gezeigt in der Lage, mehr als eine Art Xanthophyll 8,35 aufzunehmen - 38. Verschiedene Rekonstruktionen von CP26, ein anderes Pigment-Protein-Komplex höherer Pflanzen mit verschiedenen Pigmentzusammensetzungen werden in Tabelle 2 gezeigt, 39. Diese Rekonstruktionen wurden verwendet, um die Affinität der Bindungsstellen für bestimmte Pigmente 39 zu beurteilen. Es ist interessant zu bemerken, dass, um einen Komplex mit dem gleichen Pigment c erhalten1: usammensetzung wie das native einen muss der Chl a / b-Verhältnis von Pigmentmischung 3 sein. Dies scheint der Fall für alle LHC-Komplexe der höheren Pflanzen 20,40 sein. Die Kombination der Molekularbiologie mit der Rekonstitution Technik können die Eigenschaften eines Chl-bindenden Komplexes näher zu untersuchen. 44 - die Bedeutung der verschiedenen Proteindomänen auf die Stabilität und Faltung der Komplexe oder deren Einbindung in die Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden durch Abschneiden des Apoprotein oder Führen Zufallsmutagenese 8,41 bestimmt. 52 - einzelne Aminosäurereste die für die Koordinierung der verschiedenen Pigmente können durch ortsgerichtete Mutagenese, um die Eigenschaften der einzelnen Pigmente zu analysieren oder zu beurteilen, deren Beitrag zu der Funktion und Stabilität des Komplexes 10,28,29,45 verändert werden. Figur 6 zeigt rekonstituiert Lhcb4 (CP29) miteine Mutation von Histidin an Position 216, 53. Ein Vergleich der Pigmentzusammensetzung von Wildtyp-und Mutanten-Komplexen zeigt, dass die Mutation induziert den Verlust eines Chl ein Molekül, das anzeigt, dass die Zielstelle nimmt eine Chl a im WT-Komplex. Die Unterschiede der Absorptionsspektren von WT und Mutanten, bei Normierung auf den Pigmentgehalt, zeigt auch die Absorptionseigenschaften des verlorenen Pigment. In diesem Fall kann der Unterschied in der Hauptpeak bei 680 nm zu erkennen, was darauf hinweist, dass der Chl a von His216 koordiniert bei dieser Wellenlänge absorbiert (für weitere Details zu diesem Mutante und die spektroskopischen Eigenschaften sehen Mozzo et al., 2008 53). Mutationsanalyse kann auch verwendet werden, um die Wirkung der Umgebung auf die spektroskopischen Eigenschaften der Pigmente 54 zu bestimmen. Abschließend kann Lichtsammelproteine ​​leicht in vitro rekonstituiert werden, was zu Pigment-protein-Komplexe mit sehr ähnlichen Eigenschaften wie Mutterkomplexen. Auf diese Weise werden die Schwierigkeiten bei der Isolierung von nativen Proteinen eliminiert, während auch die Bereitstellung Proteinpräparat mit hoher Ausbeute und Reinheit zur weiteren Untersuchung. Die Bedeutung einer 3: 1 Chl a / b-Verhältnis bei der Herstellung eines authentischen Komplex wird hervorgehoben, und Beispiele von rekonstituierten Wildtyp und Mutante LHCs sind vorgesehen, um Anwendungen der Technik veranschaulichen.

Die Photosyntheseapparat von Pflanzen und Algen umfassen integrale Membranproteine, binden Chlorophyll (Chl a), b (Chl b) und Carotinoide (Auto). Diese Pigment-Protein-Komplexe sind in der Erntelichtenergie und übertragen diese Anregungsenergie zu den Reaktionszentren, in denen es verwendet wird, um die Ladungstrennung 2 fördern aktiv. Sie sind auch in regulatorischen Rückkopplungsmechanismen, die den Photosyntheseapparat von hoher Lichtschäden schützen 3,4 beteiligt. Die Lichtsammelkomplexe (LHCs) aus einer großen Familie von verwandten Proteinen in Pflanzen und Algen 5 besteht. Die homogene Reinigung jedes Mitglied der Familie von den hoch ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der Komplexe erschwert. Darüber hinaus führen Reinigungsverfahren oft zu einem Verlust der Pigmente oder andere potenzielle Kofaktoren wie Lipide. In-vitro-Rekonstitution Vertrets eine leistungsfähige Methode, um diese Probleme zu überwinden. Der LHC mit Photosystem II (LHC-II) zugeordnet wurde in vitro durch Plumley und Schmidt 1987 1 rekonstituiert. Die Forscher extrahiert entfetteten Protein und Pigmente getrennt von Chloroplasten, und dann kombiniert, die Hitze denaturierten Proteins mit Pigmenten in Gegenwart von Lithium Natriumdodecylsulfat (LDS), gefolgt von drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen 1. Sie zeigten, dass die spektralen Eigenschaften des rekonstituierten LHC-Komplexe sehr ähnlich waren, um Komplexe aus Pflanzen gereinigt. Die Leichtigkeit der Rekonstitution LHC Pigment-Protein-Komplexe, wahrscheinlich aufgrund eines inhärenten Selbstorganisation kennzeichnen, zusammen mit der Schwierigkeit bei der Isolierung von gereinigten Komplexe aus Organismen, führte zur schnellen Einführung des Verfahrens von anderen Forschern. Die Rekonstitution der photo Proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) überexprimiert wurde von Paulsen et al 1990 6 erreicht. In E.coli, überexprimiert Membranproteine ​​sind in der Regel in Einschlusskörpern enthalten sind, die Einrichtungen ihre Reinigung. Rekonstitution durch Hitzedenaturierung der Einschlusskörper, die rekombinantes Protein in Gegenwart von LDS, gefolgt von der Zugabe von Pigmenten, die die Proteinfaltung initiiert erreicht. Faltung des LHCII-Komplex ist ein zweistufiges Verfahren: Zunächst wird Chlorophyll a in weniger als 1 min gebunden; zweite, Chlorophyll b gebunden und über mehrere Minuten 7 stabilisiert. Zusätzlich zur Bereitstellung Einblick in die Faltungsdynamik in vitro Rekonstitution in Verbindung mit ortsgerichteter Mutagenese wurde die Identifizierung von spezifischen Aminosäuren wichtig für die Stabilität (zB 8,9) oder Pigmenten Abstimmung erlaubt (zB 10). Manipulation der Rückfaltungsbedingungen durch Anpassung der Parameter wie Pigmentzusammensetzung oder Reinigungsmittel haben auch Elemente Critica identifiziertl für die richtige Faltung, wie die Forderung der Xanthophylle für die LHCII-Komplex (zB 1,11). Zusätzlich Untersuchung der Eigenschaften des in den Komplexen gebundenen einzelnen Pigmente ist möglich unter Verwendung von Komplexen in vivo rekonstituiert (zB 10). Das hier beschriebene Verfahren beginnt mit der Isolierung der Pigmente (Chlorophylle und Carotinoid) aus Spinat und der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Die Expression und Reinigung eines LHC-Protein aus E. coli in Form von Einschlusskörpern wird dann beschrieben, gefolgt von der Wiederherstellung des LHC und anschließender Reinigung durch Ni-Affinitätssäule. Im letzten Schritt werden die rekonstituierten Komplexen durch Saccharose-Gradienten-Zentrifugation gereinigt, um freien Pigmente und ungefalteten Apoprotein entfernen. Dieses Protokoll stellt eine optimierte Verfahren, das mehrere Änderungen, die von verschiedenen Labors über eingeführt wurdenZeit 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cloth&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>Soft artists paint brush&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>O8001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>see reference 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>see reference 19</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

In Pflanzen und Grünalgen, wird von den Lichtsammelkomplexe (LHCs), eine Familie von integralen Membranproteinen, die Chlorophylle und Carotinoide koordinieren gefangen genommen. In vivo werden diese Proteine ​​mit Pigmenten gefaltet, um Komplexe, die in der Thylakoidmembran eingefügt sind, bilden des Chloroplasten. Die hohe Ähnlichkeit in der chemischen und physikalischen Eigenschaften der Mitglieder der Familie, zusammen mit der Tatsache, dass sie leicht Pigmente während der Isolierung zu verlieren, macht die Reinigung in einem nativen Zustand schwierig. Ein alternativer Ansatz zur homogenen Zubereitungen von LHCs erhalten wurde durch Plumley und Schmidt 1987 1 entwickelt, die zeigten, dass es möglich war, diese Komplexe in vitro ausgehend von gereinigten Pigmente und ungefalteten Apoproteine ​​wiederherzustellen, was zu Komplexen mit Eigenschaften sehr ähnlich zu der von nativem Komplexe. Dies eröffnet den Weg zur Verwendung von bakteriell exprimierten rekombinanten Proteinen in vitro </em&gt; Rekonstitution. Die Rekonstitution Verfahren ist leistungsfähig aus verschiedenen Gründen: (1) reine Präparate von Einzelkomplexe erhalten werden kann, (2) Pigmentzusammensetzung gesteuert werden, um ihren Beitrag zu bewerten Aufbau und Funktion werden, (3) rekombinante Proteine ​​mutierte die Funktions zu studieren Rolle der einzelnen Reste (beispielsweise Pigment-Bindungsstellen) oder Proteindomäne (zB Protein-Protein-Wechselwirkung, Falten). Dieses Verfahren wurde in verschiedenen Laboratorien optimiert und die meisten der Lichtsammelkomplexe angewendet. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren zur Wiederlichtsammelkomplexe in vitro noch in unserem Labor verwendet wird, und Beispiele beschreiben Anwendungen des Verfahrens sind vorgesehen.

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

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Serie: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Forschung

Chemie

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Biochemie

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and organization of these complexes is highly dynamic on both long and short time scales due to processes that adapt photosynthesis to changing environmental conditions (i.e., non-photochemical quenching, state transitions, and the long-term response). Historically, these processes have been described spectroscopically in terms of changes in chlorophyll fluorescence, and spectroscopy remains a vital method for monitoring photosynthetic parameters. There are a limited number of ways in which the underlying protein complex dynamics can be visualized. Here we describe a fast and simple method for the high-resolution separation and visualization of thylakoid complexes, native green gel electrophoresis. This method is coupled with time-correlated single photon counting for detailed characterization of the chlorophyll fluorescence properties of bands separated on the green gel.

Here we present a protocol to separate solubilized thylakoid complexes by Native Green Gel electrophoresis. Green gel bands are subsequently characterized by Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) and basic steps for data analysis are provided.

Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Umwelt

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologie

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Hochauflösende Bildgebung der Chlorophyll-Biosynthese in Arabidopsis-Keimlingen

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

Autor im Rampenlicht: Nicht-invasive hochauflösende Messung der Chlorophyllsynthese während der De-Etiolation

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

Zusammenfassung

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Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

Zusammenfassung

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Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments