This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1. Gesamtpigmentextraktion aus Spinatblättern <ol><li> Homogenisieren eine Handvoll Blattspinat (~ 20 g) in 100 ml kaltem Grinding-Puffer (siehe Tabelle 1) mit einem Mixer für 20 Sekunden. </li><li> Filtern der Lösung durch ein zwei Schichten aus Nylongewebe mit einem Porendurchmesser von 20 um und Zentrifuge das Filtrat bei 1500 g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Das Pellet, das die Chloroplasten mit einem weichen Pinsel Künstler malen in 1 ml kaltem Waschpuffer (siehe Tabelle 1). Sobald das Pellet resuspendiert, mit 50 ml Waschpuffer und Zentrifuge die Lösung bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet vorsichtig (Thylakoide) in 50 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 1). </li><li> Zentrifugieren der Lösung bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C vollständig zu entfernen, den Überstand. An dieser Stelle führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit, um Pigment Oxidation zu vermeiden. </li&gt; <li> Fügen ~ 20 ml 80% Aceton mit Na 2 CO 3 gepuffert (siehe Tabelle 1), um die Pigmente zu extrahieren. Verlassen Sie die Lösung auf Eis für 10 min, gelegentlich Vortexen. </li><li> Pellet die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. HINWEIS: Wenn die Pigmente nicht völlig extrahiert, wird der Pellet eine grüne Farbe haben und Schritt 1.6 sollte wiederholt werden. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit in einen Scheidetrichter. Fügen 0,4 Volumina Diethylether, kräftig schütteln und öffnen Sie das Ventil, um das Gas zu entlüften. </li><li> Fügen 0,8 Volumen von 0,33 M NaCl und kräftig mischen. ~ 10 min ermöglichen die Schichten zu trennen. Die Ether-Phase auf die extrahierten Pigmente enthält. Entfernen Sie die untere Phase. HINWEIS: Wenn die Trennung nicht klar ist, einfrieren und auftauen die Lösung, um die Phasentrennung zu verbessern. </li><li> Entfernen Sie den Äther durch Eingießen von der Oberseite der Scheidetrichter in einen geeigneten Glasbehälter. Trocken, indem Sie einen Löffel grandere wasserfreiem Natriumsulfat. Schwenken Sie die Lösung und lassen ~ 5 min für das Trockenmittel, um Wasser aus dem Äther zu absorbieren. HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Natriumsulfat erscheint völlig verklumpten; Es sollte auch frei schwebend sein, wenn die Kristalle Ether ausreichend getrocknet. Wenn eine Wasserschicht bildet, entfernen Sie diese mit einer Pasteur-Pipette, bevor zusätzliche wasserfreiem Natriumsulfat. </li><li> Dekantieren den Äther zu einem neuen Glas-Container, so dass das Natriumsulfat solide hinter sich. </li><li> Verdampft den Ether im Rotations Speedvac oder unter einem Strom von N 2. </li><li> Man löst die Pigmente vollständig in 10 ml 100% igem Aceton gewaschen. </li><li> Verdünnte eine kleine Menge (~ 3 ul) in 1 ml 80% Aceton und Messen der Absorptionsspektren und bestimmen den Chl a / b-Verhältnis und die Chl-Konzentration mit der durch Porra et al. (1989) 15. </li><li> Aliquoten und trocknen die Pigmente in einem Dreh Speedvac oder unter N 2-Strom, bis das Aceton istvollständig verdampft ist. Bewahren Sie die getrockneten Pigmente bei -80 ° C. </li></ol> 2. Extraktion der Carotinoide aus Spinat <ol><li> Führen Sie die Schritte 1.1 bis 1.5. An dieser Stelle führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit, um Pigment Oxidation zu vermeiden. </li><li> Resuspendieren thylakoid Pellet in ~ 50 ml 96% Ethanol mit Na 2 CO 3 (siehe Tabelle 1) zwischengespeichert, um die Pigmente zu extrahieren. Verlassen Sie die Lösung auf Eis für 5 min. </li><li> Pellet die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. HINWEIS: Wenn die Pigmente nicht völlig extrahiert, wird der Pellet eine grüne Farbe haben und Schritt 2.2 sollte wiederholt werden. </li><li> Sammeln des Überstandes und mit 0,1 Volumen von 80% KOH (w / v) einer Verseifung initiieren. </li><li> Verlassen Sie die Lösung bei 4 ° CO / N, fest verschlossen und vor Licht geschützt. </li><li> Sammeln Sie die Lösung in einen Scheidetrichter. 1 Volumen Diethylether und vorsichtig mischen. </li><li> 0,8 vol hinzufügenmengen von 0,33 M NaCl und vorsichtig mischen. ~ 10 min ermöglichen die Schichten zu trennen. Die orange Ether-Phase auf verseiften enthält die Carotinoide. Entfernen Sie die grüne untere Phase durch Ablassen durch den Hahn des Trichters. </li><li> Hinzufügen 3 Volumen Wasser und vorsichtig mischen, um das Kaliumhydroxid zu entfernen. Lassen Sie die Schichten zu trennen. HINWEIS: Wenn die obere Phase trübe erscheint, fügen Sie eine kleine Menge von NaCl (zB 3 g NaCl in 200 ml Lösung) und vorsichtig schwenken, sich aufzulösen. </li><li> Entfernen Sie die untere Phase durch Ablassen durch den Hahn des Trichters. </li><li> Folgen Sie den Schritten von 1,10 bis 1,13. </li><li> Verdünnte eine kleine Menge (~ 3 ul) in 1 ml 80% Aceton und Messen der Absorptionsspektren bei 440 nm in 80% Aceton. Um die Konzentration zu bestimmen, verwenden Sie die Durchschnittskoeffizient Aussterben der Carotinoide (ε 440 = 255) 16 in der folgenden Formel: Auto [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (Strahlengang) = 1 cm. </li><li> Aliquoten und trocknen Sie die carotenoids in einem Speedvac oder unter N 2-Strom, bis alle Diethylether wurde verdampft. Bewahren Sie die getrockneten Pigmente bei -80 ° C. </li></ol> 3. Gesamt Pigment und Carotinoid-Extraktion aus Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Wachsen C. reinhardtii auf festen TAP Medium 17 in einer Petrischale durch die Verbreitung eine kleine Menge Flüssigkultur auf die Oberfläche. Wachsen unter ständiger Beleuchtung Strom von 20 mmol Fotos PSA m -2 s -1 bis eine grüne Schicht von Zellen sichtbar ist. </li><li> Verwendung einer sterilen Impföse ernten eine kleine Menge von C reinhardtii vom festen TAP Medium und setzen Sie die Zellen in 500 ml Leitungsmedium 17 in einem 1 l-Kolben. Die Kultur bei 25 ° C mit 170 Upm unter Rühren unter kontinuierlicher Beleuchtung Fluß von 20 umol Fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Nach 5-6 Tagen ist die Kultur am Ende der logarithmischen Phase erreicht (6 x 10 6 Zellen / mloder 2-2,5 optische Dichte bei 750 nm). Zentrifugieren der Kultur bei 4000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> Für Gesamtpigment-Extraktion, befolgen Sie die Schritte 1,6 bis 1,15. </li><li> Die Ausbeute an Gesamtpigmentextrakt ab 500 ml Vollwachstumskultur von C. reinhardtii ist etwa 5 ml Lösung mit einer Konzentration von 0,5 mg Chl a + b / ml. </li><li> Carotinoide für Extraktion, befolgen Sie die Schritte 2,2 bis 2,12. </li></ol> 4. Reinigung von Inclusion Bodies <ol><li> Klonierung der kodierenden Sequenz des LHC Protein von Interesse in einen Expressionsvektor, der in einem kondensierten C-terminalen His-Tag unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren ergibt. Verwandeln, die dieses Konstrukt in E. coli-Wirtsstamm wie BL21 (DE3). </li><li> Vorbereitung Lysepuffer, Wasch-Puffer, Triton-Puffer TE (Tabelle 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und LB-Medium 18 mit den entsprechenden Antibiotika. </li><li> Wählen Sie eine einzE E. coli-Kolonie, enthaltend den Expressions Klon aus einer frisch ausgestrichenen Platte in ~ 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika unter Verwendung von Standardverfahren 6. Wachsen bei 37 ° C mit 220 Upm Rühren für mindestens 16 Stunden. </li><li> Hinzufügen von 2,5 ml des O / N-Kultur in einen 1 l-Erlenmeyerkolben mit 250 ml LB mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. </li><li> Wachsen die Zellen für 2-3 Stunden (oder bis die OD 600 ~ 0,6) bei 37 ° C bei 220 UpM. </li><li> Hinzufügen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C mit 220 Upm 3-4 h wachsen. </li><li> Zentrifugieren der Kultur für 10 min bei 5.000 × g bei 4 ° C in einem vorgewogenen Zentrifugenglas. Überstand verwerfen und gründlich Bestimmen Sie das Gewicht des Pellets durch Wiegen wieder und Subtraktion der Zentrifugenröhrchen Gewicht. </li><li> Resuspendieren E. coli-Zellpellet in 0,8 ml / g Lysepuffer durch kräftiges Vortexen. HINWEIS: Alternativ kann das Zellpellet bei -80 eingefrorenC für die spätere Verwendung. Wenn die mit einem gefrorenen Pellets, lassen Sie sie vollständig vor der Zugabe des Lyse-Puffer auftauen. </li><li> Add 2 mg Lysozym pro Gramm Zellen und Inkubation auf nassem Eis mit gelegentlichem Vortexen für 30 min. </li><li> Mit 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 ug / ml RNAse. Wirbel und auf Eis für 30 Minuten setzen. </li><li> 2 ml kaltem Detergenspuffer pro Gramm Zellen. Gut mischen und halten RT für 5 min. </li><li> Übertragung auf 2 ml Zentrifugenröhrchen (aufgeteilt in zwei Röhren, wenn nötig). Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> 1 ml kaltem Triton-Puffer und die Pellets durch Sonifikation (3 x 5 sec Impulse x 50% Leistung mit 20 Sekunden-Intervallen) vollständig zu suspendieren. HINWEIS: Haben Sie den Schlauch in einem kleinen Becherglas mit Eis Wasser umgeben, um sie während der Sonifikation kalt zu halten. Im Falle von Mehrfachrohren, verbinden die resuspendiert Einschlußkörper in eine Röhre nach Resuspendierung. </li><li> Zentrifugieren für 10 min bei 12.000× g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.13 und 4.14 zwei Mal. </li><li> Resuspendieren der Einschlusskörper in 1 ml kaltem TE mit Sonifikation für einen letzten Wasch die Triton-Puffer zu entfernen. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C, um die Einschlusskörper zu pelletieren. </li><li> Das Pellet in 1 ml kaltem TE durch Beschallung. </li><li> Beurteilung der Proteinkonzentration durch Standardverfahren, wie dem Bradford-Assay 19. Speicher Aliquots der Einschlusskörper bei -20 ° C. </li></ol> 5. Rekonstitution Dieses Protokoll liefert typischerweise 1-2 ml der rekonstituierten Protein mit einem Außendurchmesser von 4, wenn die Absorption in der Region Qy (600-750 nm) gemessen. Menge kann nach Wunsch eingestellt werden, wobei darauf zu achten ist, um die richtigen Verhältnisse während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: 2x Rekonstitutionspuffer, 20% OG, 2 M KCl, TE. Führen Sie das folgende sTEPs bei schwachem Licht. </li><li> Resuspendieren 800 ug LHC Inclusion Bodies in insgesamt 400 ul TE in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 400 ul der 2x Rekonstitutionspuffer und kurz vortexen. </li><li> Fügen 0,6 ul β-Mercaptoethanol (14,8 M stock), um eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten. Wärme, die das Protein für 1 min bei 98 ° C aufweist. Wirbel kurz und Ort bei RT für 3 min. </li><li> Resuspendieren 500 g Gesamt-Chlorophyll-Pigmente getrocknet plus 80 ug Carotinoidpigmente in 30 ul 100% EtOH durch kräftiges Vortexen für 1 min oder in einem Ultraschallbad für 1-2 min. </li><li> Drehen Sie das Pigment-Mix ~ 30 sec bei 15.800 xg bei 4 ° C und bestätigen, dass es keine Pellets. Wenn es ein Pellet, wiederholen Verwirbelung und / oder Ultraschallbehandlung. WICHTIG: Nach der Aufwirbelung und Spin, sofort Pigment in den das Protein, oder es kann zu aggregieren und müssen wieder suspendiert werden. </li><li> Langsam das Pigment-Mix zu dem gekühlten Protein unter Vortexen. Weiterhin Wirbel 5-10 sec und das Röhrchen auf nassem Eis. Seien Sie vorsichtig, nicht zu kräftig vortexen, wie das Protein die Spitze des Rohres überlaufen. </li><li> Fügen Sie 94 ul 20% Octyl β-D-glucopyranosid (OG) (Endkonzentration 2%), kurz vortexen und auf Eis 10 min halten. </li><li> Fügen Sie 90 ul von KCl 2 M (Endkonzentration 150-200 mM), kurz vortexen und auf Eis 20 min halten. HINWEIS: Säulenvorbereitung (Abschnitt 6) kann zu diesem Zeitpunkt eingeleitet werden. </li><li> Spin für 10 min bei 15.800 × g bei 4 ° C ist. Überstand entfernen, ohne das Pellet (gefälltes LDS) in einen 10-ml-Röhrchen stören. Halten Kälte und vor Licht geschützt. </li></ol> 6. Nickel Säulenreinigung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: OG-Puffer, OG Spülpuffer, Elution Puffer. </li><li> Verbinden einer Ni-Sepharose-Säule (1 ml) oder äquivalent zu einer Schlauchpumpe gewährleistet, dass keine Luft in der Säule wird bei diesem Schritt und die nachfolgenden Schritte. </li><li> Stellen Sie die Geschwindigkeit von ter zu pumpen, um 1 ml / min und spülen Sie die Säule mit 5-10 ml Wasser, um die Storage-Lösung zu entfernen. </li><li> Ins Gleichgewicht der Säule mit 3-4 ml OG-Puffer. </li><li> Zusatz von 3-4 ml OG-Puffer zu der Proteinprobe und der Last auf die Säule. Hinweis: Wenn das Protein wurde auf Eis nach der Entfernung des LDS sitzen länger als 10 min, wieder drehen sich mit 15.800 g bei 4 ° C für 1 min, um zusätzliche LDS Niederschlag zu entfernen. </li><li> Spülen der Säule mit 5 ml OG-Puffer. </li><li> Mit 2 ml OG Spülpuffer Spülen der Säule. </li><li> Elution des gebundenen Proteins mit 3 ml Elutionspuffer. Sammeln Sie die grüne Eluat, das die wiederhergestellten Protein enthält. Hinweis: Dies ist in der Regel etwa 1 ml insgesamt. </li></ol> 7. Saccharosegradientenzentrifugation <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben: Saccharose-Lösung, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6. </li><li> Füllen Ultrazentrifuge Rohre mit der Saccharose-Lösung und bei -20 ° CO / N or -80 ° C für mindestens 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch aus dem Gefrierschrank und lassen Sie bei 4 ° C auftauen ungestört. HINWEIS: Die Frost / Tau-Verfahren erzeugt einen Gradienten von 0,1 bis 1 M Saccharose. Eine 15-ml-Tube taut in der Regel in etwa 3 Stunden. </li><li> Sorgfältig von oben zu entfernen das gleiche Volumen wie die grüne Fraktion aus der Nickel-Sepharose-Säule in Schritt 6.8 eluiert. Dann laden Sie die rekonstituierte Probe langsam auf, um zu vermeiden das Gefälle zu stören. </li><li> Balance Rohren und Spin bei 200.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge mit einem SW-41 oder SW-60 Ausschwingrotor für 18 Stunden, eingestellt, um die Beschleunigung und Stoppen ohne Bremsen verlangsamen. </li><li> Sie vorsichtig die Gradienten von der Rohrhalter mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine Spritze mit langer Nadel, die eine stumpfe Öffnung, um den Anteil von der Spitze zu sammeln hat. HINWEIS: Alternativ sammeln Fraktionen von unten durch Anstechen des Röhrchens mit einer Nadel und Sammeln Tropfen. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Membranproteine ​​sind nicht so leicht zu untersuchen. Isolierung von nativen Membranproteine ​​wird durch die Notwendigkeit, die Lipid-Doppelschicht mit Detergenzien solubilisieren, die das Protein beschädigen und zu entfernen wesentlichen Kofaktoren kompliziert. Diese Proteine ​​können auch in geringen Mengen vorhanden sein, die in biologischen Membranen oder mit eng verwandten Proteinen gemischt werden, wie im Fall der Lichtsammelkomplexe, die die Reinigung der einzelnen Komplexe erschwert. Heterologe Proteinexpression in E. coli und in vitro Rekonstitution bietet die Möglichkeit, diese Probleme zu vermeiden. In vitro Rekonstitution und Reinigung von gefalteten Proteinen führt zu Komplexen, die Eigenschaften sehr ähnlich denen des nativen Komplexe 20,21,23 und besitzen somit verwendet werden, um Komplexe, die nicht bis zur Homogenität gereinigt werden können, 24 zu untersuchen - 27. Dieses Verfahren verwendet Spinat, die leicht ist attainable ganze Jahr über, als Quelle für den Gesamtpigment und Carotinoid-Zubereitungen. Für einige Rekonstruktionen von Proteinen stammt aus Algen ist die Verwendung von Pigmenten aus Algen gereinigt aufgrund unterschiedlicher Pigmentzusammensetzungen bevorzugt. Das Chl a / b-Verhältnis und Chl / Auto Verhältnis gleich bleibt, unabhängig von Pigmentquelle. Es ist wichtig zu erkennen, dass der Wirkungsgrad der Rekonstitution ist in der Regel rund 35% 28. Somit ist es erforderlich, die nicht-gebundene Pigmente und das entfaltete Apoprotein aus der Lösung nach dem Auflösen zu entfernen. Ein Zwei-Schritt-Reinigungsprotokoll wird in diesem Protokoll vorgestellt (siehe Ergebnisse). Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Saccharose-Gradienten Schritt nicht die vollständige Trennung der Apo-und Holo-Protein zu ermöglichen. Bei den meisten Analysen ist dies kein Problem, da das Apoprotein keine Pigmente enthalten und somit nicht mit den funktionellen Messungen stören. In dem Fall ist es jedoch notwendig, die Apoprotein vollständig entfernen aus der FRAktion mit dem rekonstituierten Komplexes (zum Beispiel, um das Pigment zu Protein-Stöchiometrie berechnen), kann eine anionische Austauschsäule verwendet werden (siehe Passarini et al. 2009 29 für Details). Die Fähigkeit zur rekombinanten Lichtsammelproteine ​​mit isolierten Pigmente in vitro Rückfaltung bietet die Möglichkeit, &quot;manipulieren&quot; die Komplexe durch Änderung der Rekonstitution &quot;Umwelt&quot; in verschiedener Weise, wodurch sich die Eigenschaften des resultierenden Komplexes. Zum Beispiel kann die Änderung der Pigmentzusammensetzung bei der Rekonstitution in einem Komplex mit veränderten Pigmentzusammensetzung führen. Diese Funktion kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Pigmente auf der Struktur und Stabilität des Komplexes zu untersuchen. Regel die Pigmentzubereitung aus Spinat erhalten wird, eine Chl a / b-Verhältnis von 3: 1 und einen Chl / Auto-Verhältnis von 2,9: 1 liegt. Dieses Verhältnis typischerweise eine rekonstituierte Protein mit den gleichen Eigenschaften wie der nAtive einem. 33 - jedoch kann die Einstellung der Chl a / b-Verhältnis durch Zugabe von gereinigtem Chl a oder b die Bindung von verschiedenen Pigmenten aufgrund der unterschiedlichen Selektivität der Bindungsstellen 30 zu beeinflussen. Dies ist möglich, weil die meisten der Pigmentbindungsstellen sind nicht vollständig selektiv für Chl a und Chl b, kann aber auch unterzubringen, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität 10,30,34. In ähnlicher Weise wurden die Carotinoid-Bindungsstellen auch gezeigt in der Lage, mehr als eine Art Xanthophyll 8,35 aufzunehmen - 38. Verschiedene Rekonstruktionen von CP26, ein anderes Pigment-Protein-Komplex höherer Pflanzen mit verschiedenen Pigmentzusammensetzungen werden in Tabelle 2 gezeigt, 39. Diese Rekonstruktionen wurden verwendet, um die Affinität der Bindungsstellen für bestimmte Pigmente 39 zu beurteilen. Es ist interessant zu bemerken, dass, um einen Komplex mit dem gleichen Pigment c erhalten1: usammensetzung wie das native einen muss der Chl a / b-Verhältnis von Pigmentmischung 3 sein. Dies scheint der Fall für alle LHC-Komplexe der höheren Pflanzen 20,40 sein. Die Kombination der Molekularbiologie mit der Rekonstitution Technik können die Eigenschaften eines Chl-bindenden Komplexes näher zu untersuchen. 44 - die Bedeutung der verschiedenen Proteindomänen auf die Stabilität und Faltung der Komplexe oder deren Einbindung in die Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden durch Abschneiden des Apoprotein oder Führen Zufallsmutagenese 8,41 bestimmt. 52 - einzelne Aminosäurereste die für die Koordinierung der verschiedenen Pigmente können durch ortsgerichtete Mutagenese, um die Eigenschaften der einzelnen Pigmente zu analysieren oder zu beurteilen, deren Beitrag zu der Funktion und Stabilität des Komplexes 10,28,29,45 verändert werden. Figur 6 zeigt rekonstituiert Lhcb4 (CP29) miteine Mutation von Histidin an Position 216, 53. Ein Vergleich der Pigmentzusammensetzung von Wildtyp-und Mutanten-Komplexen zeigt, dass die Mutation induziert den Verlust eines Chl ein Molekül, das anzeigt, dass die Zielstelle nimmt eine Chl a im WT-Komplex. Die Unterschiede der Absorptionsspektren von WT und Mutanten, bei Normierung auf den Pigmentgehalt, zeigt auch die Absorptionseigenschaften des verlorenen Pigment. In diesem Fall kann der Unterschied in der Hauptpeak bei 680 nm zu erkennen, was darauf hinweist, dass der Chl a von His216 koordiniert bei dieser Wellenlänge absorbiert (für weitere Details zu diesem Mutante und die spektroskopischen Eigenschaften sehen Mozzo et al., 2008 53). Mutationsanalyse kann auch verwendet werden, um die Wirkung der Umgebung auf die spektroskopischen Eigenschaften der Pigmente 54 zu bestimmen. Abschließend kann Lichtsammelproteine ​​leicht in vitro rekonstituiert werden, was zu Pigment-protein-Komplexe mit sehr ähnlichen Eigenschaften wie Mutterkomplexen. Auf diese Weise werden die Schwierigkeiten bei der Isolierung von nativen Proteinen eliminiert, während auch die Bereitstellung Proteinpräparat mit hoher Ausbeute und Reinheit zur weiteren Untersuchung. Die Bedeutung einer 3: 1 Chl a / b-Verhältnis bei der Herstellung eines authentischen Komplex wird hervorgehoben, und Beispiele von rekonstituierten Wildtyp und Mutante LHCs sind vorgesehen, um Anwendungen der Technik veranschaulichen.

Die Photosyntheseapparat von Pflanzen und Algen umfassen integrale Membranproteine, binden Chlorophyll (Chl a), b (Chl b) und Carotinoide (Auto). Diese Pigment-Protein-Komplexe sind in der Erntelichtenergie und übertragen diese Anregungsenergie zu den Reaktionszentren, in denen es verwendet wird, um die Ladungstrennung 2 fördern aktiv. Sie sind auch in regulatorischen Rückkopplungsmechanismen, die den Photosyntheseapparat von hoher Lichtschäden schützen 3,4 beteiligt. Die Lichtsammelkomplexe (LHCs) aus einer großen Familie von verwandten Proteinen in Pflanzen und Algen 5 besteht. Die homogene Reinigung jedes Mitglied der Familie von den hoch ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der Komplexe erschwert. Darüber hinaus führen Reinigungsverfahren oft zu einem Verlust der Pigmente oder andere potenzielle Kofaktoren wie Lipide. In-vitro-Rekonstitution Vertrets eine leistungsfähige Methode, um diese Probleme zu überwinden. Der LHC mit Photosystem II (LHC-II) zugeordnet wurde in vitro durch Plumley und Schmidt 1987 1 rekonstituiert. Die Forscher extrahiert entfetteten Protein und Pigmente getrennt von Chloroplasten, und dann kombiniert, die Hitze denaturierten Proteins mit Pigmenten in Gegenwart von Lithium Natriumdodecylsulfat (LDS), gefolgt von drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen 1. Sie zeigten, dass die spektralen Eigenschaften des rekonstituierten LHC-Komplexe sehr ähnlich waren, um Komplexe aus Pflanzen gereinigt. Die Leichtigkeit der Rekonstitution LHC Pigment-Protein-Komplexe, wahrscheinlich aufgrund eines inhärenten Selbstorganisation kennzeichnen, zusammen mit der Schwierigkeit bei der Isolierung von gereinigten Komplexe aus Organismen, führte zur schnellen Einführung des Verfahrens von anderen Forschern. Die Rekonstitution der photo Proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) überexprimiert wurde von Paulsen et al 1990 6 erreicht. In E.coli, überexprimiert Membranproteine ​​sind in der Regel in Einschlusskörpern enthalten sind, die Einrichtungen ihre Reinigung. Rekonstitution durch Hitzedenaturierung der Einschlusskörper, die rekombinantes Protein in Gegenwart von LDS, gefolgt von der Zugabe von Pigmenten, die die Proteinfaltung initiiert erreicht. Faltung des LHCII-Komplex ist ein zweistufiges Verfahren: Zunächst wird Chlorophyll a in weniger als 1 min gebunden; zweite, Chlorophyll b gebunden und über mehrere Minuten 7 stabilisiert. Zusätzlich zur Bereitstellung Einblick in die Faltungsdynamik in vitro Rekonstitution in Verbindung mit ortsgerichteter Mutagenese wurde die Identifizierung von spezifischen Aminosäuren wichtig für die Stabilität (zB 8,9) oder Pigmenten Abstimmung erlaubt (zB 10). Manipulation der Rückfaltungsbedingungen durch Anpassung der Parameter wie Pigmentzusammensetzung oder Reinigungsmittel haben auch Elemente Critica identifiziertl für die richtige Faltung, wie die Forderung der Xanthophylle für die LHCII-Komplex (zB 1,11). Zusätzlich Untersuchung der Eigenschaften des in den Komplexen gebundenen einzelnen Pigmente ist möglich unter Verwendung von Komplexen in vivo rekonstituiert (zB 10). Das hier beschriebene Verfahren beginnt mit der Isolierung der Pigmente (Chlorophylle und Carotinoid) aus Spinat und der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Die Expression und Reinigung eines LHC-Protein aus E. coli in Form von Einschlusskörpern wird dann beschrieben, gefolgt von der Wiederherstellung des LHC und anschließender Reinigung durch Ni-Affinitätssäule. Im letzten Schritt werden die rekonstituierten Komplexen durch Saccharose-Gradienten-Zentrifugation gereinigt, um freien Pigmente und ungefalteten Apoprotein entfernen. Dieses Protokoll stellt eine optimierte Verfahren, das mehrere Änderungen, die von verschiedenen Labors über eingeführt wurdenZeit 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

In Pflanzen und Grünalgen, wird von den Lichtsammelkomplexe (LHCs), eine Familie von integralen Membranproteinen, die Chlorophylle und Carotinoide koordinieren gefangen genommen. In vivo werden diese Proteine ​​mit Pigmenten gefaltet, um Komplexe, die in der Thylakoidmembran eingefügt sind, bilden des Chloroplasten. Die hohe Ähnlichkeit in der chemischen und physikalischen Eigenschaften der Mitglieder der Familie, zusammen mit der Tatsache, dass sie leicht Pigmente während der Isolierung zu verlieren, macht die Reinigung in einem nativen Zustand schwierig. Ein alternativer Ansatz zur homogenen Zubereitungen von LHCs erhalten wurde durch Plumley und Schmidt 1987 1 entwickelt, die zeigten, dass es möglich war, diese Komplexe in vitro ausgehend von gereinigten Pigmente und ungefalteten Apoproteine ​​wiederherzustellen, was zu Komplexen mit Eigenschaften sehr ähnlich zu der von nativem Komplexe. Dies eröffnet den Weg zur Verwendung von bakteriell exprimierten rekombinanten Proteinen in vitro </em&gt; Rekonstitution. Die Rekonstitution Verfahren ist leistungsfähig aus verschiedenen Gründen: (1) reine Präparate von Einzelkomplexe erhalten werden kann, (2) Pigmentzusammensetzung gesteuert werden, um ihren Beitrag zu bewerten Aufbau und Funktion werden, (3) rekombinante Proteine ​​mutierte die Funktions zu studieren Rolle der einzelnen Reste (beispielsweise Pigment-Bindungsstellen) oder Proteindomäne (zB Protein-Protein-Wechselwirkung, Falten). Dieses Verfahren wurde in verschiedenen Laboratorien optimiert und die meisten der Lichtsammelkomplexe angewendet. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren zur Wiederlichtsammelkomplexe in vitro noch in unserem Labor verwendet wird, und Beispiele beschreiben Anwendungen des Verfahrens sind vorgesehen.

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K Aufrufe.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Serie: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Forschung

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...