Dieses Protokoll kann erfolgreich angewendet werden, um sowohl wichtige entzündliche und fibrotische Reaktion in beiden Lungen durch endotracheale Injektion von Bleomycin zu induzieren und neue entzündungshemmende und antifibrotische systemische Therapien durch Schwanzveneninfusion zu validieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die direkte Injektion von Bleomycin in die Mausluftröhre eine schnelle Ausrichtung der Lunge ohne Verschüttungen in der oberen Atemwege gewährleistet, was eine sichere, robuste und reproduzierbare Induktion von Lungenentzündung und Fibrose ermöglicht. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Fiorenza Orlando, einem Tierarzt aus unserem Kooperierenden Labor.
Positionieren Sie zunächst die anästhesierte Maus auf dem Rücken auf einer chirurgischen Plattform. Befestigen Sie seine Beine zart mit chirurgischen Bandstreifen, um sie an Ort und Stelle zu halten. Um den Hals der Maus hyper zu verlängern, legen Sie eine Stütze wie Zahnbaumwolle Rolle unter seinem Zervixbereich.
Dann verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Kehle sanft zu rasieren. Verwenden Sie ein Paar anatomische Zangen, um die Haut zu kneifen. Verwenden Sie ein Paar Ring gehandhabt gekrümmte stumpfe Schere, um einen kurzen Schnitt etwa einen halben Zentimeter in der Länge in Übereinstimmung mit der Maus sternohyoid Muskel zu machen.
Verwenden Sie Wattestäbe, um Blutungen zu stoppen. Dann die Luftröhre durch stumpfe Sezieren aussen und sanft von Fett und anderen Geweben reinigen. Drehen Sie die chirurgische Plattform, um die Maus mit dem Kopf an dem Bediener zu orientieren, was es dem Bediener während der Injektion ermöglicht, die Spritze richtig zu winkeln.
Um die Luftröhre zu visualisieren, stellen Sie die Maus unter ein Operationsmikroskop. Stellen Sie die Beleuchtung ein und stellen Sie die Vergrößerung zwischen 1 und 1,2 ein, und passen Sie dann den Fokus und die Schärfe an. Die Luftröhre kann leicht als weißes transluzentes Rohr mit gut sichtbaren Trachealringen unterschieden werden.
Pipette vorsichtig zur Mischung der Bleomycin-Lösung und Aspirieren von 100 Mikrolitern in eine 0,5-Milliliter-Spritze mit einer 25-Grad-Nadel, die Blasenbildung vermeidet. Sobald die Luftröhre klar visualisiert ist, punktieren Sie sie vorsichtig mit der Nadelspitze in einem 30-Grad-Winkel. 100 Mikroliter Bleomycin langsam direkt in das Lumen der Luftröhre injizieren.
Nachdem Sie einige Sekunden gewartet haben, bis das gesamte Volumen die Nadel hinunterfährt, entfernen Sie sie aus der Luftröhre. Beobachten Sie ein paar Sekunden Apnoe auftreten, wenn die Nadel richtig in die Luftröhre eingeführt wird, was darauf hindeutet, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen eingeatmet wurde. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel sicher.
Schließen Sie die subkutane Faszien und die Hautwunde mit einer 5-0 resorbierbaren Naht und lassen Sie das Tier sich erholen. Nach der erneuten Anästhesisierung der Maus und sobald die Bewusstlosigkeit bestätigt ist, legen Sie die Maus unter eine sterile Kapuze. Verwenden Sie eine Gesichtsmaske mit einem kontinuierlichen Fluss von 1,5%isoflurane, um eine sanfte Anästhesie während des Experiments aufrechtzuerhalten.
Um die Vasodilatation zu fördern und eine einfachere Injektion zu ermöglichen, den Schwanz zwei Minuten in warmes Wasser einweichen. Mischen Sie eine Suspension der menschlichen Nabelschnur mesenchymale stromale Zellen durch sanfte Pipettieren, um Zellklumpenbildung zu vermeiden. 200 Mikroliter in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Spur-Nadel aspirieren, um Blasenbildung zu vermeiden.
Halten Sie den Schwanz an der Spitze und richten Sie ihn sanft. Dann lokalisieren Sie die seitliche Vene des Schwanzes. Den Schwanz vorsichtig mit einem Skalpell kratzen und mit 70% Ethanol abwischen.
Ausgehend vom distalen Teil des Schwanzes, legen Sie die Nadel in die Vene in einem 15-Grad-Winkel. Langsam infundieren 200 Mikroliter menschlichen Nabelschnur mesenchymale stromal Zellen. Um eine erfolgreiche intravenöse Infusion zu überwachen, beobachten Sie die Flüssigkeit, die ohne Widerstand und mangelnde Extravasation in die Vene gelangt.
Nachdem Sie einige Sekunden gewartet haben, bis das gesamte Volumen die Nadel hinunterfährt, entfernen Sie sie aus der Vene. Dann drücken Sie kurz mit einer sterilen Gaze Druck auf die Eingangswunde, um Blutungen zu verhindern und das Tier erholen zu lassen. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel nach der Infusion sicher.
Nach der Bleomycin-Injektion wurden die histopathologischen Veränderungen der Lunge durch Hämatoxylin und Eosin und Picrosirius Red Staining bewertet, die eine extensive entzündliche Infiltration und Fibrose im Vergleich zur normalen Lungenarchitektur nach salinöser Injektion bestätigten. Bleomycin-induzierte Lungenentzündung und Fibrose wurden weitgehend durch menschliche Nabelschnur mesenchymale Stromalzellinfusion, aber nicht durch Salin abgeschwächt. Die Kollagenablagerung wurde mit Hydroxyprolin-Assay gemessen.
Nach Bleomycin-Injektion, Hydroxyprolinspiegel schrittweise erhöht von Tag acht auf Tag 14 und 21. Während die Zugabe von menschlichen Nabelschnur mesenchymale stromale Zellen deutlich reduziert die Auswirkungen von Bleomycin. Expressionsniveaus des Col1A1-Typ-eins-Kollagengens in der gesamten Lungen-mRNA zeigten auch an den Tagen acht, 14 und 21 einen progressiven Anstieg, der durch die Behandlung der menschlichen Nabelschnur mesenchymal stromal zelliert teilweise reduziert wurde.
Die Immunfärbung mit spezifischen Antikörpern zeigte, dass infundierte menschliche Nabelschnur mesenchymale Stromalzellen schnell und effektiv die Lungen der Maus erreichten, obwohl nur wenige Zellen nachgewiesen wurden. Diese Daten deuten auf eine schnelle Dislokation der Zellen von der Standortverletzung trotz der anhaltenden Schutzwirkung hin. Der Einsatz eines Operationsmikroskops sorgt für hohe Erfolgssicherheit, da der Bediener die korrekte Platzierung der Nadel in die Mausluftröhre vor der Installation genau überwachen kann, wodurch das Risiko einer Beschädigung minimiert wird.
