Name: generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
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This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist. 1. Mäuse <ol><li> Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden. </li></ol> 2. Herstellung von Komplettmedium <ol><li> Vorbereitung Komplettmedium durch Zugabe der folgenden Komponenten zu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, 10% fötales Kälberserum (FCS), 50 uM 2-Mercaptoethanol, 100 uM Asparagin, 2 mM Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung. </li></ol> 3. Vorbereitung der Enzymlösungen <ol><li> Bereiten Kollagenase D-Lösung in einem 15 ml konischen Bodenrohr. <ol><li> Man wiegt 10 mg Kollagenase D. Dissolve Kollagenase D in 4 ml Vollmedium. </li></ol></li><li> Bereiten Pronase-Lösung in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Man wiegt 10 mg Pronase. </li><li> Plus 5 ul 1 M Tris-Puffer (pH 8,0). 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Füllen Sie mit 494 &amp; mgr; l sterilem Wasser. </li><li> Inkubieren Pronaselösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung von Collagenase D-Pronase Mix (≤2 Tails) Hinweis: Führen Sie die nachfolgenden Schritte in einem sterilen Zellkultur Kapuze. <ol><li> Add 250 ul Pronase Lösung auf 4 ml Kollagenase D-Lösung. </li><li> Übergeben Sie die Collagenase D-Pronase Mischung durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein steriles 15 ml konischen Bodenrohr. </li></ol> 5. Gewinnung von Fibroblasten von Ohr und Schwanz Tissues <ol><li> Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.</li><li> Zeigen autoklaviert chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette) in der Zellkultur Kapuze. </li><li> 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen je. </li><li> Geschnitten Ohren (~ 1 cm Radius) und 5 cm des Schwanzes (von der Spitze des Schwanzes) einer Maus mit Schere und Inkubation für 5 min in 40 ml 70% igem Ethanol in einem sterilen 50 ml konischen Unterrohr. </li><li> Luft trocknen Ohren und Schwanz, indem sie in einer offenen 10 cm Zellkulturschale in der Haube für 5 min. Einmal getrocknet, Transfer Ohr und Schwanzstücke, zwei Kulturschalen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;, die 10 ml Vollmedium wie in Schritt 5.3 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie Haare aus den Ohren und Schwanz mit einer Schere. </li><li> Schneiden Ohren und Schwanz in Stücke kleiner als 3 mm in der Größe mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die geschnittenen Gewebe in 1,8 ml Kryoröhrchen Fläschchen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot; und fügen Sie eine ausreichende Kollagenase D-Pronaselösung für das Volumen, um das 1,8-ml-Markierung auf der Flasche zu erreichen. </li><li> Pschnüren die Kryoröhrchen Fläschchen horizontal auf einem Shaker und schütteln Sie die Proben bei 200 Upm für 90 min bei 37 ° C. </li><li> Nach 90 min Inkubation, entfernen Sie die Kryoröhrchen Vials aus dem Schüttler und legen Sie die Durchstechflaschen in der Kapuze. </li><li> 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen, die mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot; jeder, und legte eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb in jedem Gericht. </li><li> Legen Sie die verdaut Ohr und Schwanz Gewebe in der 70 &amp; mgr; m Zellsieb in den entsprechend gekennzeichnet Gerichte in Schritt 5.11 vorbereitet und kraftvoll mahlen das Gewebe mit einer 10 ml Spritzenkolben für&gt; 5 min. Schütteln Sie die Zellsieb gelegentlich in dem Medium, um Zellen aus der Zelle Sieb waschen. </li><li> Pipettieren Sie die Zellsuspension aus jeder Schale in zwei 15 ml konischen Boden Rohre mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;. Waschen Sie die Teller und Sieb mit zusätzlichen 10 ml Komplettmedium und fügen Sie das Medium in die entsprechenden 15 ml konischen Boden Rohre. </li><li> Spin down die ZelleSuspension 7 min bei ~ 580 × g und 4 ° C unter Verwendung einer Kühlzelle Zentrifuge. </li><li> Überstand entfernen, 10 ml Komplettmedium auf das Zellpellet in 15 ml konischen Boden Rohr und die Zellen resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.14 und 5.15. </li></ol> 6. Die Kultivierung des Zellgemisches <ol><li> Überstand entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet ungestört bleibt. </li><li> Re-suspend-Zellen in 10 ml Vollmedium und fügen Sie die entsprechende Mischung auf zwei 10 cm Zellkulturschalen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Amphotericin B-Lösung (Stammlösung: 250 &amp; mgr; g / ml) zu der Kultur. </li><li> Zellen bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am dritten Tag, ersetzen Sie das Medium, das mit 10 ml frisches vollständiges Medium, das 10 &amp; mgr; l von Amphotericin B, um Ablagerungen zu entfernen (Abbildung 1 und 2). </li></ol> 7. Sub-Kultur von Fibroblasten <ol><li> When Kultur erreicht etwa 70% Konfluenz (Tag 3-4 Kultur) Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 5 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Entfernen PBS und 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen. </li><li> Die Zellen 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach 5 min, klopfen Sie leicht das Kulturschale und 6 ml Vollmedium zu den Zellen. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Boden Rohr und drehen Sie das Rohr für 5 min bei ~ 450 xg und 4 ° C unter Verwendung eines Kühlzelle Zentrifuge. </li><li> Überstand abnehmen und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 5 ml Vollmedium. </li><li> Samen 2 x 10 5 Zellen in einer 10 cm Zellkulturschale und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 3-4 Tage vor der Wiederholung der Schritte 7.1 bis 7.6. </li></ol> 8. Herstellung von Ohren für den Versand Hinweis: Führen Sie ter nachfolgende Schritte in einer sterilen Zellkultur Kapuze. <ol><li> Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts. </li><li> Zeigen autoklaviert Schere und Pinzette in die Zellkultur Kapuze. </li><li> 50 ml vollständigem Medium in einem 50 ml konischen Unterrohr. </li><li> Schneiden Sie die Ohren (~ 1 cm Radius) einer Maus mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die Ohren in die 50 ml konischen Bodenrohr mit einer Pinzette (wie in Schritt 3 hergestellt). </li><li> Verschließen Sie die 50 ml konischen Bodenrohr mit Parafilm vor dem Versand bei RT in einer entsprechenden Box. </li></ol>

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The authors declare no conflict of financial interests.

Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand 15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten werden seneszenten, durch die Abflachung der Zellen angegeben, werden größer (2-3 mal Erhöhung) und Versagen zu erweitern. Bei der Durchführung der Isolierung der Fibroblasten, muss die Aufmerksamkeit während der Unterbrechung der Gewebe zu bezahlen, als nicht ausreichend, Schneiden oder Verdauung werden in geringen Rückgewinnung von Fibroblasten zur Folge haben. Es ist möglich, das Ohr und Schwanz Fibroblasten zu bündeln, um die Anzahl der Fibroblasten erhöhen. Zusätzlichen Tissue einschließlich Peritonealdialyse und in der gleichen Weise verarbeitet Lungengewebe hinzugefügt werden, um t zu erhöhenEr Anzahl von Fibroblasten. Obwohl Trümmer in der Kultur folgenden Fibroblasten Extraktion vorhanden ist, wird es empfohlen, das Medium erst nach dem dritten Tag ändern Fibroblasten die Zeit nehmen, um die Zellkulturschalen haftet. Eine potentielle Beschränkung des Protokolls ist die Verwendung von nicht-sterilen Gewebe und damit verbundenen Möglichkeit einer mikrobiellen Kontamination. Um das Risiko der Kontamination zu reduzieren, werden die Ohren und Schwanz in 70% Äthanol vor dem Ernten der Fibroblasten inkubiert. Weiterhin wird die antimykotische Amphotericin B auf der Primärkultur zugegeben, um den Auswuchs von Hefe und Pilzen, ein gemeinsames Problem zu vermeiden, wenn zur Festlegung Fibroblastenkulturen. Das Medium enthält auch Penicillin und Streptomycin, um bakterielle Kontamination zu verhindern. Mit diesen Vorkehrungen sind Kontaminationen selten beobachtet, auch bei der Festlegung von Fibroblasten von Ohren und Schwanz, die bei Raumtemperatur für mehrere Tage aufbewahrt wurden. Einer der wichtigsten Vorteile dieses Protokolls liegt in dem abilkeit auf Fibroblasten von Ohren, die in Medium bei Raumtemperatur für bis zu 10 Tage vor Fibroblasten Isolierung gespeichert wurden, zu generieren. Wir beobachteten eine geringfügig verminderte Effizienz bei der Festlegung Ohr Fibroblastenkultur nach 10 Tagen Lagerung (70-80% Konfluenz wird innerhalb von 5-6 Tagen im Vergleich zu 3-4 Tage frisch isoliertem Gewebe erreicht). Daher kann die Ohren von Mäusen, die von den Forschern mit Standard-Versand ausgetauscht werden, wenn auch Express-Sendungen wird empfohlen. Nach unserer Erfahrung, die Benutzerfreundlichkeit, um die Ohren und die Tatsache, dass das Gewebe wird selten für experimentelle Verfahren verwendet erhalten können oft Zugang zu Gewebe von genetisch veränderten Mäusen, die zeitraubende, anders zu erhalten sein könnten. Für Schwänzen die Effizienz der Rückgewinnung von Fibroblasten nach der Lagerung kann stark variieren und Schwänzen sollten nur verwendet werden, wenn die Ohren sind nicht für den Versand zur Verfügung. Schließlich sollten die meisten Menschen in der Lage, um das Protokoll auszuführen, da die Ernte von Gewebe erfordert minimale Erfahrung und Ausbildung im Umgang mit Mäusen. Das Protokoll nur mit Mausgewebe getestet, sollte aber in der Theorie ermöglicht die Erzeugung von Fibroblastenkulturen unter Verwendung von Gewebe anderer Spezies, obwohl das Protokoll kann eine weitere Optimierung benötigen.

Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien 1 stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen 2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen. Üblicherweise verwendete primäre Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, T-Zellen, B-Zellen, Knochenmark-Makrophagen (BMDM) und Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC). Fibroblasten werden oft als primäre Zellkultur-Modell genutzt. Sie bieten entscheidende Vorteile gegenüber anderen Primärzellen. Die Zellkulturen werden leicht hergestellt, leicht aufrechterhalten und erfordern keine Purification der Zellen vor der Kultur. Sie haben schnellen anfänglichen Proliferation und keine Voraussetzung für die Fachmedium oder Aktivierungsprotokolle. Fibroblasten lassen sich effizient mit biologischen, chemischen und physikalischen Protokollen 4,5 transfiziert werden. Gibt es eine Möglichkeit, um die Ohren für bis zu 10 Tage bei RT vor der Etablierung von Zellkulturen zu speichern. Fibroblastenkulturen sind förderlich für die Visualisierung von zytoplasmatischen Prozesse und für die Neuprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 6. Fibroblasten sind wichtige Zellen des Bindegewebes, die Kollagen-Proteine ​​der extrazellulären Matrix 7 sekretieren. Sie stellen den strukturellen Rahmen in vielen Geweben 8 und spielen eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparatur 9,10. Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (&lt;4 h) Protokoll, um Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse 11 zu etablieren. Das Protokoll erfordert nur minimale MausErfahrung, um das Gewebe (im Gegensatz zu anderen Protokollen 12,13) ​​zu ernten und kann verwendet werden, um Kulturen von Ohren in Medium bei RT für bis zu 10 Tage gelagert zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absolute for analysis</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>From &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;, lyophilized, non-sterile</td></tr><tr><td>Pronase protease</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>From &lt;em&gt;Streptomyces griseus&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Tris buffer (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td>Ultra pure grade</td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1053</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td><td>Ultra pure grade</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &amp;mu;g/ml in deionized water, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;M syringe filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M cell strainer</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Syringe plunger</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial tube</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Cell culture treated dish&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml conical bottom tube</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical bottom tube</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Incubation shaker</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25 light microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues

Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.

Extraktion von Fibroblasten, die aus Gewebe in einer signifikanten Menge an Gewebetrümmer (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Gewebetrümmer, Fibroblasten haften an Gewebekulturkunststoffoberflächen zwischen Tag 1 und 3 der Kultur. Das Medium der Fibroblastenkulturen kann sicher an Tag 3 der Kultur, die die Pegel der vorliegenden Trümmer in der Kultur (2) signifikant verringern sollte verändert werden. Fibroblasten zeigen eine längliche Morphologie und eine deutlich sichtbare Zytoplasma (1 und 2). Mitotischen Zellen von Tag 3 der Kultur weiter vorhanden sein sollten und Zellen sollten 70-80% der Zellkonfluenz innerhalb von 3-4 Tagen der Kultur zu erreichen. Die Ausbeute von Ohr und Schwanz Geweben in einer 10 cm Kulturschale im Bereich von 4 bis 5 x 10 5 (ears) und 5 bis 6 x 10 5 Zellen (Schwanz) am Tag 3 der Kultur. Nach dem dritten Tag der Fibroblasten Isolation können die Zellen passagiert und ausgesät, auf 2 x 10 5 Zellen pro 10 cm-Kulturschale. Extraktion von Fibroblasten, die aus den Ohren bei RT für 10 Tage gelagert werden, sollten in 70-80% Zellkonfluenz innerhalb 5-6 Tagen Kultur (Figur 3) führen. Aussäen der Zellen bei 2 × 10 5 Zellen pro 10 cm-Kulturschale für Tag 5 sollten ebenfalls auf ca. 1 x 10 6 Zellen in 3-4 Tagen Kultur. Langzeitlagerung hat keinen Einfluss auf die Zeit, die für Fibroblasten Seneszenz in unserer Erfahrung ein (Daten nicht gezeigt). Um die Identität der Zellen nach 3 Tagen Kultur zu überprüfen, können Zellen, die für die Fibroblasten-Marker Vimentin 14. Unter Verwendung des obigen Protokolls markiert werden, wir routinemßig reinen Fibroblastenkulturen erhalten, wie von Vimentin Anfärbung (Figur 4) angedeutet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion vor der mittel ändern.Repräsentative Hellfeld Bilder von Zelltrümmern (weiße Pfeile) an Tag 3 der Kultur präsent. Bilder wurden bei 100-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53565/53565fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion nach der Zugabe des neuen Mediums. Repräsentative Hellfeld Bilder von Fibroblasten am Tag 3 in der Kultur. Die Bilder wurden bei 100-facher und 320-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53565/53565fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion aus bei RT für 10 Tage gespeichert Ohrgewebe. Repräsentative Hellfeld Bilder von Fibroblasten am Tag 3 in der Kultur. Die Bilder wurden bei 100-facher und 320-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53565/53565fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig4.jpg" /> Abbildung 4. Kennzeichnung von Fibroblastenkulturen für Vimentin. Repräsentative konfokales Bild von Ohr und Schwanz Fibroblasten an Tag 3 der Kultur. Fibroblasten, die aus den Geweben extrahiert wurden Vimentin (rot) und DAPI (blau) markiert. Die Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale micros erworbenKopie. Der Maßstab entspricht 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53565/53565fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.7K Aufrufe.  Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore.  Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden. 

Serie: Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative strategies for treatment of heart disease. This conversion has been achieved by forced expression of defined factors such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T). Traditionally, iCMs are generated by a cocktail of viruses expressing these individual factors. However, reprogramming efficiency is relatively low and most of the in vitro G,M,T-transduced fibroblasts do not become fully reprogrammed, making it difficult to study the reprogramming mechanisms. We recently have shown that the stoichiometry of G,M,T is crucial for efficient iCM reprogramming. An optimal stoichiometry of G,M,T with relative high level of M and low levels of G and T achieved by using our polycistronic MGT vector (hereafter referred to as MGT) significantly increased reprogramming efficiency and improved iCM quality in vitro. Here we provide a detailed description of the methodology used to generate iCMs with MGT construct from cardiac fibroblasts. Isolation of cardiac fibroblasts, generation of virus for reprogramming and evaluation of the reprogramming process are also included to provide a platform for efficient and reproducible generation of iCMs.

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Krebsforschung

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Biotechnik

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Biologie

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...