Strukturelle Untersuchungen von Mikrotubuli-interagierenden Proteinen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie sind entscheidend, um zelluläre Mechanismen zu verstehen. Die Präparation homogener Mikrotubuli, die an interagierende Proteine auf einem Kryo-EM-Gitter gebunden sind, ist entscheidend für den Erfolg. Dieses Protokoll ist einfach, kostengünstig und ermöglicht es, Mikrotubuli mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen in ausreichender Menge und Qualität für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu präparieren.
Mikrotubuli sind sehr temperaturempfindlich. Es ist daher wichtig, die Mikrotubuli-haltigen Lösungen warm zu halten, um eine Depolymerisation zu verhindern. Zu Beginn wird eine genetisch veränderte HCT116-Zelllinie in DMEM-Zellkulturmedium kultiviert, bis sechs bis 12 konfluierende Platten erhalten werden.
Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 Millilitern PBS, um jegliches Zellkulturmedium zu entfernen. Lösen Sie die Zellen von den Platten, indem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit drei Millilitern eiskaltem PBS, ergänzt mit fünfmillimolarem EDTA, inkubieren und anschließend einen Zellschaber verwenden. Sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 250 g.
Notieren Sie das Volumen der entnommenen Zellen mit der volumetrischen Skala auf dem Röhrchen. Resuspendieren Sie das geerntete Zellpellet in einem gleichen Volumen Lysepuffer und lysieren Sie die Zellen durch Beschallung. Nach der Beschallung werden für die SDS-PAGE-Analyse zwei Mikroliter Lysat in ein Röhrchen mit 18 Mikrolitern Wasser und fünf Mikroliter 5X SDS-Probenpuffer gegeben.
Die restlichen lysierten Zellen werden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert und eine Stunde lang bei 100.000 G bei vier Grad Celsius in einem Ultrazentrifugenrotor geschleudert, um das Lysat zu klären. Entfernen Sie mit einer Spritze das geklärte Lysat, ohne das Pellet und die schwimmende Schicht zu stören. Geben Sie zwei Mikroliter geklärtes Lysat in ein Röhrchen mit 18 Mikrolitern Wasser und fünf Mikrolitern 5X SDS-Probenpuffer.
Spülen Sie das Pellet vorsichtig ab und schöpfen Sie ein wenig von dem Pellet auf, indem Sie eine P-10-Pipettenspitze durch das Pellet schwenken. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Wasser und 50 Mikroliter SDS-Puffer hinzu. Geben Sie ein millimolares GTP und 20 mikromolare Paclitaxel in einen gesammelten Überstand, um die Mikrotubuli zu polymerisieren, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Mikrotubuli zusammensetzen können.
Bereiten Sie den Polsterpuffer vor, indem Sie 600 Mikroliter Glycerin zu 400 Mikrolitern Lysepuffer hinzufügen und die Mischung mit 20 mikromolaren Paclitaxel ergänzen. Den Puffer auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Geben Sie 800 Mikroliter Kissenpuffer in ein Ultrazentrifugenröhrchen.
Pipettieren Sie dann das mit GTP-Paclitaxel angereicherte Lysat vorsichtig auf den Kissenpuffer. Legen Sie das Röhrchen in einen Ultrazentrifugenrotor, um es 30 Minuten lang bei 100.000 G bei 30 Grad Celsius zu schleudern. Markieren Sie die nach außen gerichtete Kante des Röhrchens, um leicht zu erkennen, wo sich das Mikrotubuli-Pellet bilden sollte.
Entfernen Sie den Polsterpuffer nach dem Zentrifugieren vorsichtig mit einer Pipette, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie vorsichtig Lysepuffer neben das Pellet, drehen Sie das Röhrchen einige Male, um so viel Glycerin wie möglich aus dem Pellet und den Wänden des Röhrchens zu entfernen, und saugen Sie dann den Waschschritt ab und wiederholen Sie ihn dreimal. Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet vorsichtig mit einer abgeschnittenen Spitze in 50 Mikroliter vorgewärmtem Resuspensionspuffer und platzieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius.
Fügen Sie zwei Mikroliter resuspendierte Pelletfraktion in 18 Mikroliter Wasser und fünf Mikroliter 5X SDS-Probenpuffer hinzu. Bereiten Sie das Tauchgefriergerät vor, indem Sie das Löschpapier einlegen. Stellen Sie die Gerätetemperatur auf 30 Grad Celsius und die Befeuchtung auf 100 % einLassen Sie das Gerät 30 Minuten lang ausgleichen.
Bereiten Sie die Einstellungen des Tauchgefrierschranks für zwei Anwendungen vor. Stellen Sie für die erste Anwendung die Kraft auf 10, zwei Sekunden Blot-Zeit und null Sekunden Wartezeit ein. Stellen Sie für die zweite Anwendung die Kraft auf 10, 6,5 Sekunden Blotzeit und 10 Sekunden Wartezeit ein.
Legen Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben in das Metallglühentladungsfahrzeug. Glow entlädt die Kryo-Elektronenmikroskopie oder EM-Gitter bei 30 Milliampere für 60 Sekunden. Kühlen Sie die Styroporbehälterbaugruppe mit flüssigem Stickstoff und bereiten Sie flüssiges Ethan in einem Metallbecher zu, indem Sie Ethangas zu einem kalten Metallbecher kondensieren.
Verdünnen Sie das Mikrotubuli-interagierende Protein in gleichem Volumen mit Verdünnungspuffer, bevor Sie es auf die Gitter auftragen, um die Zellkonzentration zu senken. Stellen Sie den Mixer auf 37 Grad Celsius. Verwenden Sie einen warmen Metallblock in einer isolierenden Styroporbox, wenn sich kein Heizblock in der Nähe des Tauchgefriergeräts befindet.
Schnappen Sie sich mit einer Tauchpinzette ein Glühgitter und klicken Sie sie in den Tauchgefrierschrank. Stellen Sie den Styroporbehälter mit flüssigem Ethan in den Tauchgefrierschrank und durchlaufen Sie das vorbereitete Programm. Tragen Sie zunächst 3,5 Mikroliter Mikrotubuli-Lösung auf das Gitter auf.
Lassen Sie den Tauchgefrierschrank den Rost abtupfen. Tragen Sie dann sofort 3,5 Mikroliter verdünntes Protein auf. Und zum Schluss lassen Sie den Kolben abtupfen und das Gitter in flüssigem Ethan einfrieren.
Übertragen Sie die Gitter in eine Gitteraufbewahrungsbox und lagern Sie sie bis zur Bildgebung in einem Dewar mit flüssigem Stickstoff. Die Qualität und Konzentration der extrahierten Mikrotubuli wurde mittels Coomassie-gefärbtem SDS-Gel bestimmt. Eine nichtlineare Regressionslinie der relativen BSA-Größen, abgeleitet aus der Interpolation des Mikrotubuli-Bandes um 50 Kilodalton in der P2-Spur mit der BSA-Kurve, ergibt eine Endkonzentration von 1,42 Milligramm pro Milliliter.
Dies stimmt gut mit der Zahl überein, die von zwei Personen mit einem Spektralphotometer gemessen wird. Die frisch extrahierten Mikrotubuli wurden zur Herstellung von Kryo-EM-Proben verwendet. Die Mikrotubuli sehen auf den Schliffbildern intakt und reichlich vorhanden aus.
Die Mikrotubuli-Dichte pro Aufnahme sollte nicht zu hoch sein, um zu vermeiden, dass sich die Mikrotubuli überkreuzen. Gebrochene Mikrotubuli deuten darauf hin, dass die Mikrotubuli depolymerisiert sind oder dass die Konzentration der Mikrotubuli zu dicht war. Mikrotubuli, die an MATCAP gebunden waren, wiesen raue Kanten auf, die durch elektronendichte Punkte auf der Mikrotubuli-Oberfläche gekennzeichnet waren.
Auch MATCAP-gebundene und MATCAP-ungebundene Mikrotubuli konnten in den berechneten 2D-Klassen unterschieden werden. Die Herstellung von Kryo-EM-Gittern mit dieser Methode kann es ermöglichen, die Struktur von Mikrotubuli zu untersuchen, die an ein spezifisches interagierendes Protein gebunden sind. Dies kann zu einem besseren Verständnis der Mechanismen in der strukturellen Zellbiologie führen.
