Der Hauptvorteil dieses Assays ist die Einfachheit und Genauigkeit, da es keine Embryospülung erfordert, um auf die Lebensmitteldurchstechflasche zu übertragen, und die Verluste durch technische Fehler vermeidet. Dieses Protokoll erfordert keine fachkundigen technischen Fähigkeiten. Das richtige Timing und die sorgfältige Wasserübertragung sind jedoch wichtig für ihre Genauigkeit und Reproduzierbarkeit.
Demonstriert wird dieses Verfahren von Antonio Rockwell, einem kürzlich abgeschlossenen Doktoranden aus meinem Labor. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, gießen Sie Traubenagar in eine 35-Millimeter-Petrischale halb voll und lassen Sie den Agar für eine Stunde erstarren. Wenn der Agar erstarrt ist, verwenden Sie ein kleines Plastikmesser, um die Oberfläche des Agars an der Außenseite der Platte sanft zu kratzen, sodass die Mitte der Platte frei von Kratzern bleibt.
Dann legen Sie eine kleine Menge frisch zubereitethefe Paste in die Mitte der Schale und legen Sie die Schale in eine Embryo-Sammlung Mini-Käfig. Für die Embryo-Sammlung, ersten Platz zwei jungfrauen Drosophila Weibchen und ein junges Männchen in der Sammlung Käfig für 24 Stunden. Am nächsten Tag den Boden der Agarplatte inspizieren, um nach Embryonen zu suchen.
Wenn Embryonen verlegt wurden, übertragen Sie die Agarplatte in eine feuchte Kammer und bedecken Sie die Platte mit dem Deckel, um Austrocknung zu vermeiden. Wenn mehrere Tage der Verlegung erzielt werden sollen, legen Sie eine neue Agarplatte in den Sammelkäfig. Verwenden Sie das Mikroskop, um die Anzahl der geschlüpften Embryonen und L1-Larven zu bestimmen, und geben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in die feuchte Kammer zurück, bis alle Embryonen geschlüpft sind und sich zu L1-Larven entwickelt haben.
Zählen Sie nach 48 Stunden die Anzahl der geschlüpften Embryonen und L1-Larven und verwenden Sie einen Spachtel, um die Scheibe des Traubenagars vorsichtig aus der Petrischale zu entfernen, indem Sie die Scheibe L1-Seite auf dem Lebensmittel in einer Lebensmitteldurchstechflasche platzieren, die groß genug ist, um die Scheibe aufzunehmen. Dann die Petrischale sorgfältig auf restliche Larven untersuchen. Überwachen Sie die Lebensmitteldurchstechflasche täglich ungefähr zur gleichen Zeit jeden Tag, um zu bestätigen, dass die L2- und L3-Larven beobachtet werden können, die ihren Weg zum Essen finden.
Erfassen Sie die Anzahl der Pupae und erwachsenen Drosophila, weiterhin zählen, bis keine Erwachsenen mehr beobachtet werden und vermeiden, die nachfolgende Generation zu zählen. Führen Sie dann eine Chi-Quadrat-Analyse durch. Die Nullhypothese geht von einer 100%igen Lebensfähigkeit aus, so dass die Anzahl der Erwachsenen der Anzahl der ursprünglich aufgezeichneten und auf die Nahrungsfläschchen übertragenen Fläschchen entspricht.
Wenn der Agar auf der Seite der Durchstechflasche platziert wird, reifen viele der Embryonen und Larven nicht zu Erwachsenen, wahrscheinlich aufgrund der Austrocknung der Traubenagarscheibe. Wenn der Traubenagar mit dem Gesicht nach unten in der Durchstechflasche in direktem Kontakt mit der Nahrungsoberfläche platziert wird, gehen in der Regel weniger als 6% der Nachkommen verloren, da der Agar hydratisiert bleibt, während er mit der Feuchtigkeit der Instantnahrung in der Durchstechflasche in Berührung kommt. In diesem repräsentativen Experiment, das die Entwicklung von Wildtyp und mutierter Nachkommen verglichen, reiften etwa 91% der mutierten Nachkommen mit dieser Methode bis zum Erwachsenenalter, verglichen mit 94% der Nachkommenschaft von Wildtypfliegen.
Denken Sie daran, die Agarscheibe Embryo-Seite nach unten in die Nahrungsdurchstechflasche zu übertragen und dann, um die leere Petrischale auf alle verbleibenden Larven zu überprüfen, die nicht übertragen wurden. Ein weiterer entscheidender Schritt ist die Übertragung der Agarscheibe auf eine Lebensmitteldurchstechflasche spätestens 48 Stunden nach dem Entfernen der Trauben-Agar-Platte aus der Embryo-Sammlung Mini-Käfige, um Austrocknung zu verhindern.
