Das aktuelle Protokoll ist von Bedeutung, da es forschern ermöglicht, siRNA-geladene Nanopartikel herzustellen und diese Nanopartikel angemessen zu charakterisieren, um ihre Eignung für die Verabreichung an Tiere vor späteren Studien zu gewährleisten. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, Nanopartikel zu produzieren, die die Bioverfügbarkeit von siRNA erhöhen, und Nanopartikel zu produzieren, die neutral geladen und somit für die systemische Verabreichung geeignet sind. Diese Technik ist wirkungsvoll, da siRNA-Nanopartikel zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt werden können, die eine systemische Verabreichung erfordern, darunter Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen, unter anderem.
Zunächst polymer in Ethanol in einer Konzentration von 33,3 Milligramm pro Milliliter auflösen und rühren, um die Auflösung zu gewährleisten. Dann verwenden Sie eine Pipette, um Polymerlösung in 10 Millimolaren Zitronensäurepuffer zu übertragen, um eine Konzentration von 3,33 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Fügen Sie destilliertes Wasser in eine Röhre mit kleiner störender RNA ein, um eine Konzentration von 50 Mikromolaren zu erreichen.
Mischen Sie die Polymer- und kleinen störenden RNA-Lösungen gründlich in einem Rohr, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um ein Stickstoff-Phosphat-Verhältnis von 10 zu erreichen. Legen Sie das Rohr 30 Minuten bei Umgebungstemperatur auf. Dann fügen Sie einen Milliliter 10 Millimolar Phosphatpuffer bei pH 8 in das Rohr, um eine Konzentration von 0,28 Milligramm pro Milliliter zu erreichen und mischen Sie vorsichtig entweder durch Pipettieren oder Invertieren der Röhre.
Um zu bestätigen, dass der endgültige pH-Wert neutral ist, um 7,2 bis 7,5, Pipette 10 Mikroliter der kleinen störenden RNA-Nanopartikellösung auf die pH-Teststreifen. Bereiten Sie zunächst eine dynamische Lichtstreuungsprobe vor, indem Sie einen Milliliter kleiner störender RNA-Nanopartikel in der Konzentration von 0,28 Milligramm pro Milliliter durch Spritzenfilter in einer Porengröße von 0,45 Mikrometern in eine quadratische Quarz- oder Polystyrol-Küvette filtern. Zeichnen Sie dann Größen- und Oberflächenladungsmessungen mit einem dynamischen Lichtstreuungsgerät nach herstellerspezifischen Vorgaben auf.
Um die Größe und Morphologie kleiner störender RNA-Nanopartikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie zu bestätigen, fügen Sie zunächst fünf Mikroliter gefilterter kleiner interferierender RNA-Nanopartikellösung mit 0,28 Milligramm pro Milliliter zu jedem TEM-Raster hinzu. Platzieren Sie die Gitter 60 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur. Mit Filterpapier drei Sekunden trocknen.
Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter 3%Uranylacetat-Lösung zu jedem Gitter hinzu und brüten für 20 Sekunden. Drei Sekunden lang trocknen. Dann legen Sie die Gitter in einem Trockenhaus, um über Nacht zu trocknen, bevor Sie unter Transmissionselektronenmikroskopie bildgeben.
Um die Agarose-Gel-Retardierung durchzuführen, fügen Sie zunächst zwei Gramm Elektrophorese-Grade-Agarosepulver zu 100 Millilitern 1X Tris-Acetat-EDTA Puffer bei pH 8 in einem Becher hinzu, um 2%Agarose-Gel zu produzieren. Rühren, um die Agarose auszusetzen. Legen Sie den Becher in einer Mikrowelle freigelegt, um für ein bis drei Minuten zu erhitzen, bis alle Agarose gelöst ist.
Nach dem Abkühlen fünf Mikroliter Ethidiumbromid in der Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in den Becher geben und gut vermischen. Dann gießen Sie die Agarose in ein Geltablett und legen Sie Kamm, um Brunnen zu produzieren. Lassen Sie das Gel 30 Minuten trocknen.
Entfernen Sie vorsichtig den Kamm, um Ladebrunnen zu hinterlassen, und gießen Sie 1X Tris-Acetat-EDTA Puffer in das Geltablett, um es bis zur maximalen Fülllinie zu füllen. Dann legen Sie zwei Mikroliter Aliquots von Ladefarbstoff ohne SDS oder Reduktionsmittel auf Paraffinfolie für jede kleine störende RNA-Nanopartikelformulierung bei unterschiedlichen Stickstoff-Phosphat-Verhältnissen. Pipette zum Mischen von 10 Mikrolitern kleiner störender RNA-Nanopartikellösung mit Ladefarbstoff auf Paraffinfolie.
Fügen Sie die Mischung zu Agarose Gel Brunnen. Schließen Sie das Elektrophoresesystem an ein Netzteil an und führen Sie die Spannungsquelle bei 100 Volt für 35 Minuten oder bis die Proben 80 % der Gellänge durchlaufen haben. Übertragen Sie das Gel aus dem Tablett auf einen UV-Transilluminator und visualisieren Sie die kleinen störenden RNA-Bänder am UV-Transilluminator nach herstellerspezifischen Spezifikationen.
Bestimmen Sie das optimale Stickstoff-Phosphat-Verhältnis basierend auf dem Verschwinden kleiner störender RNA-Bänder an der Unterseite des Gels. Um Modellgen luziferase zu fallen, erste Kern-Luziferase-exzierende Zellen in einer 96-well schwarz wandförmigen Platte mit DMEM in 10%FBS bei einer Dichte von 2.000 Zellen pro Brunnen. Legen Sie die Platte über Nacht in einen Inkubator, damit die Zellen haften können.
Am Morgen Medien entfernen und 10 Mikroliter kleiner störender RNA-Nanopartikel hinzufügen, die zu vollserummedien verdünnt werden, um eine abschließende kleine störende RNA-Konzentration von 100 Nanomolar zu erreichen. Bringen Sie die Brunnen für 24 Stunden in den Inkubator zurück, um die Zellen mit kleinen störenden RNA-Nanopartikeln zu behandeln. Ersetzen Sie am nächsten Tag Medien durch vollständige Serummedien mit 150 Mikrogramm pro Milliliter D-Luciferin.
Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Lumineszenz auf einem Plattenleser messen. Dann wiederholen Sie die Medien Erfrischung zweimal mit frischen vollen Serum-Medien frei von D-Luziferin, gefolgt von Inkubation für 24 Stunden. Ersetzen Sie die Medien durch vollständige Serummedien, die 150 Milligramm pro Milliliter D-Luzifferin enthalten, und brüten Sie bei Raumtemperatur fünf Minuten lang.
Messen Sie die Lumineszenz am 48-Stunden-Zeitpunkt. Für Längsschnittstudien den Deckel auf der Brunnenplatte lassen, wenn sie außerhalb des Biosicherheitsschranks sind, um Zellen unter sterilen Bedingungen zu erhalten und die Inkubation fortzusetzen, nachdem luziferinhaltige Medien durch frische Vollmedien ersetzt wurden. Dynamische Lichtstreumessungen zeigen, dass kleine störende RNA-Nanopartikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 35 Nanometern haben.
Das Vorhandensein eines einzelnen Peaks mit schmaler Spitzenbreite weist auf eine unimodale Verteilung und eine geringe Polydispersität hin. TEM-Messungen bestätigen die Größenmessung durch dynamische Lichtstreuung, die das Vorhandensein einer einheitlichen Population kleiner störender RNA-Nanopartikel nahelegt und die sphärische Morphologie der kleinen störenden RNA-Nanopartikel aufdeckt. Eine zu hohe Polymerkonzentration im Vorbereitungsschritt führte zu kleinen störenden RNA-Nanopartikeln zwei mit unerwünschtem Durchmesser von mehr als 200 Nanometern, einer multimodalen und polydispergierten Population und Aggregaten in Lösung, die keine eindeutige Partikelmorphologie bilden.
Sowohl kleine störende RNA-Nanopartikel eins als auch zwei zeigen neutrale Oberflächenladungen, die mit nahe Null mittleren Zeta-Potenzialwerten angezeigt werden. Agarose-Gel-Retardierung-Assay zeigt das Verschwinden kleiner störender RNA-Bänder am Gelboden, was auf eine Komplexierung kleiner störender RNA zu Polymer hindeutet. Polymerkomplexige kleine störende RNA kann nicht durch das Gel wandern und wird somit an der Oberseite des Gels in der Nähe der Ladebrunnen visualisiert.
Mit der Erhöhung des Stickstoff-Phosphat-Verhältnisses erhöht sich die kleine störende RNA-Komplexierung, wie durch eine verringerte Intensität des kleinen störenden RNA-Bandes am Gelboden angezeigt wird. Bioaktive Luziferase kleine störende RNA Nanopartikel zeigt deutlich verminderte Luziferase-Aktivität im Vergleich zu Rührkontrolle. Im Gegensatz dazu gilt Luziferase kleine störende RNA Nanopartikel zwei nicht als bioaktiv.
Um konsistente siRNA-Nanopartikel mit den gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften herzustellen, sollte man Polymerlösungen mit entsprechenden Konzentrationen verwenden und den pH-Wert der Pufferlösungen bei jedem Schritt des Protokolls validieren. Mit diesen Methoden in unserer Forschung konnten wir siRNA-Nanopartikel-basierte Therapien für zuvor undruggnable krebserregende Gene produzieren und die Wirksamkeit dieser Therapien in präklinischen Modellen von Brustkrebs testen.
