Anhand der hier vorgestellten Assays kann der Unterschied im Phänotyp unter Rotavirusstämmen bewertet werden, wo einzigartige Stämme isoliert werden. Konkret wird die phänotypische Veränderung desdesinfektionsmittelresistenter Rotavirusstämme untersucht. Um klare quantitative Ergebnisse mit dem Plaque-Assay zu erreichen, ist es wichtig, eine geeignete Kombination aus Rotavirus-Stamm und Serum auszuwählen, bei der das Rotavirus gut an das Serum angepasst ist.
Demonstriert wird das Verfahren von Syun-suke Kadoya, einem Doktoranden aus meinem Labor. Entfernen Sie ein CryoTube mit MA104-Zelllinien aus dem flüssigen Stickstoffbehälter. Legen Sie die CryoTube in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Zellen aufzutauen.
Fügen Sie einen Milliliter der Zellsuspension zu 20 Millilitern des serumhaltigen Mediums in einem T75-Kolben hinzu. Inkubieren Sie den Kolben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 für zwei bis drei Tage. Sobald die Zellmonoschicht 80% Konfluenz erreicht hat, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern 1X Dulbeccos PBS.
Fügen Sie vier Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA in den Kolben und inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen. Die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und Zentrifuge bei 190 g für fünf Minuten übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierten Zellen in einem Milliliter Serum-haltigen Medium wieder auf.
Dann verdünnen Sie die resuspendierten Zellen 100-fach mit dem Medium. Fügen Sie drei Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu jedem Brunnen einer Sechs-Well-Platte für den Plaque-Assay hinzu. Fügen Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte für den zellbindenden Assay hinzu.
Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigtem Dampf für zwei oder drei Tage. Übertragen Sie eine Röhre mit einem Milliliter der Virussuspension in einem serumfreien Medium aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in ein 37 Grad Celsius Wasserbad zum Tauen. Fügen Sie ein Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin aus der Pankreas des Schweines zu einem Milliliter der Virussuspension hinzu und wirbeln Sie dann.
Inkubieren Sie die Virussuspension bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigtem Dampf für 30 Minuten. Verdünnen Sie die aktivierte Virussuspension mit serumfreiem Medium, um die Infektionsvielfalt oder MOI auf 0,1 pfu pro Zelle anzupassen. Fügen Sie drei Tage nach der Zellbeschichtung einen Milliliter der verdünnten Virussuspension in einen T75-Kolben ein.
Bebrüte die Zellen mit Virus bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und schüttelte den Kolben alle 15 Minuten sanft. Dann 30 Milliliter eines serumfreien Mediums mit vier Mikrogramm Pro Milliliter Trypsin aus der Schweinebauchspeicheldrüse in den Kolben geben. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigten Dampf.
Sammeln Sie einen Milliliter des Überstandes in der Flasche bei Null, sechs, 12, 18, 24 und 36 Stunden nach der Infektion, und ersetzen Sie den Überstand in den 1,5-Milliliter-Typen mit einer Pipette. Führen Sie einen Frost-Tau-Zyklus innerhalb von 15 Minuten bei minus 80 Grad Celsius, gefolgt von einer 15-minütigen Schmelze in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Dann zentrifugieren Sie die Rohre bei 12, 600 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Sammeln Sie den Überstand. Filtern Sie den Überstand mit einem destillierten 0,2-Mikron-Filter, um die Zellfraktion zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius auf, bis er auf den Plaque-Assay zur Messung des Virustiters aufgebracht wird.
Wenn Sie bereit sind, den Plaque-Test durchzuführen, legen Sie die Rohre mit dem gesammelten Überstand in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Trypsin zu einem Milliliter 10-fach verdünnter Probe hinzufügen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Waschen Sie während dieser 30-minütigen Inkubation die MA104-Zellen sorgfältig in einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern 1X PBS, nachdem Sie das serumhaltige Medium entfernt haben.
Die inkubierten Proben mit serumfreiem Medium seriell verdünnen und jeweils einen Milliliter der verdünnten Probe in jeden Brunnen impfen. Bebrüte die Platte 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigtem Dampf, und schütteln Sie die Platte alle 15 Minuten sanft. Nach der Inkubation das Inokulum von der Sechs-Brunnen-Platte entfernen.
Fügen Sie dem vorbereiteten Medium vier Mikrogramm pro Milliliter Trypsin hinzu. Sanft, aber sofort drei Milliliter des Mediums mit Agarose-Gel gemischt zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie das Agarose-Gel bei Raumtemperatur für mehr als 10 Minuten erstarren.
Dann inkubieren Sie die Platte für zwei Tage bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 untergesättigten Dampf. Als Nächstes fügen Sie einen Milliliter 0,015%Neutral Red Lösung mit 1X PBS verdünnt, um jeden Brunnen, und inkubieren mit den gleichen Bedingungen. Entfernen Sie den Farbstoff nach drei Stunden und weiter für einen Tag zu inkubieren.
Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Plaques in jedem Brunnen und berechnen Sie den Pfu pro Milliliter. Überprüfen Sie sorgfältig den Zellzusammenfluss vor dem Plaque-Test, um die Plaque-Nummern zu gewährleisten. Für den zellbindenden Assay ein Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin aus einer Schweinebauchspeicheldrüse zu einem Milliliter der Virussuspension hinzufügen und dann Wirbel.
Verdünnen Sie die Virussuspension mit serumfreiem Medium, um den MOI auf einen Pfu pro Zelle einzustellen. Waschen Sie die MA104-Zellen zweimal in einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter Tris-gepufferter Kochsaline. Impfen Sie nun die Zellen mit 100 Mikrolitern verdünnter Virussuspension in jeden Brunnen der 24-Well-Platte.
Die Platte bei vier Grad Celsius 90 Minuten lang mit sanftem Schütteln alle 15 Minuten bebrüten. Entfernen Sie das Virus inoculum, und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter Tris-gepufferte Salin. Um die doppelsträngige RNA des Rotavirus zu extrahieren, fügen Sie 140 Mikroliter 1X PBS und 560 Mikroliter des RNA-Extraktionspuffers zu jedem Brunnen hinzu.
Mischen Sie mit einer Pipette, bis der Dunst der Zellen im Puffer nicht gesehen wird. Nach der Wiederherstellung der doppelsträngigen RNA, nach dem Protokoll des Herstellers, legen Sie die 1,5 Milliliter-Röhren, die den doppelsträngigen RNA-Extrakt enthalten, fünf Minuten lang auf einen Wärmeblock bei 95 Grad Celsius, um die RNA zu denaturieren. Dann sofort die Rohre auf Eis legen und für mehr als zwei Minuten inkubieren.
Synthetisieren Sie die cDNA mit einem Reverse-Transkriptionskit. Fügen Sie vier Mikroliter denaturierter viraler RNA-Lösung in eine PCR-Röhre mit 16 Mikroliter Reaktionsgemisch ein und mischen Sie sie sorgfältig mit einer Pipette, um keine Blasen zu erzeugen. Nach dem Abspinnen der Rohre, führen Sie die umgekehrte Transkription mit einem Thermocycler.
Verwenden Sie für die quantitative PCR eine Quencher-Inserting-Sonde, die auf den Bereich 963 bis 1, 049 des NSP3-Genomsegments des Rotavirus abzielt. Das Standard-Plasmid mit PCR-Wasser wird seriell verdünnt, und machen Sie den Master-Mix für quantitative PCR. Fügen Sie 20 Mikroliter der Master-Mischung in die Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.
Mischen Sie dann fünf Mikroliter cDNA-Proben oder fünf Mikroliter des Standardplasmids, indem Sie 10 Mal pipetieren. Führen Sie quantitative PCR entsprechend den Bedingungen im Textprotokoll durch. Berechnen Sie schließlich das Rotavirus-Genom, das an die MA104-Zelloberfläche gebunden ist, wie im Textprotokoll beschrieben.
Hier ist eine Wachstumskurve des Rotavirus zu sehen. Wenn die Methode am wenigsten quadratisch auf ein modifiziertes Gompertz-Modell angewendet wird, wird die spezifische Wachstumsrate auf 0,197 geschätzt, und die Verzögerungsdauer wird auf 6,61 Stunden geschätzt. Der relative Virustiter in der stationären Phase zum initialen Titer ist 3.15.
Von den sechs getesteten Rotavirus-Klonen lagen die geschätzten Werte der spezifischen Wachstumsrate zwischen 0,19 und 0,27. Diese Schätzwerte sind zuverlässig, da der Bestimmungskoeffizient im Modellfitting wert ist mehr als 0,98. Das Ergebnis des zellbindenden Assays wird als Bindungseffizienz angezeigt, d. h. das Verhältnis gebundener Viruspartikel zu denen, die im Inokulum vorhanden sind.
Unsere RV-Virionsbindung an Zelloberflächen beträgt ca. 10.000 Kopien pro Milliliter bei einer Bindungseffizienz von ca. 1%, wenn eine 24-Well-Platte für den Zellbindungstest verwendet wird. Da kultivierte Zellen empfindlich auf körperliche Belastungen reagieren, achten Sie darauf, den Puffer und Agar sanft, aber schnell zu gießen. Im Wesentlichen wurde ein neues System für die Viren eingeführt.
Mit diesem System können wir die reale Zellbindungsfähigkeit und spezifische Wachstumsrate mit Instrumenten bewerten. Unser Protokoll ist vorteilhaft bei der Messung der phänotypischen Eigenschaft. Durch die Überprüfung verschiedener neu auftauchender Stämme können Sie helfen, die neuen Impfstoffe gegen die Viren zu bewerten.
Die Viren sind als BSL-2-Erreger bezeichnet, daher müssen Sie BSL-2-Experimentalräume für dieses Verfahren vorbereiten.
