Unsere homodimerischen PROTACs sind die ersten chemischen Inhibitoren von Cereblon und können dazu beitragen, den molekularen Mechanismus von Thalidomid-Analogen weiter aufzuklären und die physiologische Funktion von Cereblon zu untersuchen. Diese neue PROTAC-Plattformtechnologie kann sehr hilfreich sein, um gezielt auf Proteine von Interesse zu zielen, die ansonsten als unnachtastbar angesehen werden. CRBN-Hemmung allein hat keine Anti-Tumor-Aktivität.
CRBN-Degrader können jedoch klinische Auswirkungen auf Fettleibigkeit, Infektionskrankheiten und andere Erkrankungen haben. Die Synthese ist anspruchsvoll und es ist schwierig, optimale Linker und Anhaftung zu finden, um effektive Protein-Degrader zu erzeugen, wenn eine PROTAC-Verbindung entwirft. Zu Beginn 2,46 Gramm Boc-geschütztes L-Glutamin und 50 Milliliter Tetrahydrofuran in einen 100-Milliliter-Rundkolben geben und eine Minute lang bei 800 U/min rühren.
Fügen Sie dann 1,95 Gramm 1,1'carbonyldiimidazol und eine katalytische Menge an 4-Pyridin hinzu. Weiter rühren für 10 Stunden bei Reflux, um eine klare farblose Lösung der Glutarimid-Verbindung zu erhalten. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.
Lösen Sie den Rückstand in 200 Milliliter Ethylacetat auf und gießen Sie ihn in einen Trenntrichter. Waschen Sie die organische Schicht mit je 50 Millilitern entionisiertem Wasser und Salzlake und trocknen Sie die organische Schicht über Natriumsulfat. Schwerkraft filteren die Lösung durch Kieselgel, um das Delikatessen zu entfernen, und spülen Dann das Kieselgel mit 200 Milliliter Ethylacetat ab.
Entfernen Sie das Lösungsmittel aus dem Filtrat unter Vakuum, um Compound 1 als farblosen Festkörper zu erhalten. Trocknen Sie das Produkt über Nacht unter Vakuum, bevor Sie es verwenden. Als nächstes lösen Sie 0,50 Gramm Natriumacetat in 20 Milliliter Eisessigsäure in einem 100 Milliliter Rundkolben mit Rührstab.
Fügen Sie 1,25 Gramm 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid und 1,14 Gramm Glutarimid und rühren bei Reflux für sechs Stunden, um eine lila Lösung von Compound 3 zu erhalten. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen, und gießen Sie sie dann in 100 Milliliter entionisiertes Wasser und rühren Sie für 10 Minuten, um Compound 3 auszustoßen. Sammeln Sie den Feststoff durch Filtration, waschen Sie ihn mit Wasser und Erdölether und trocknen Sie ihn zwei Tage lang unter Vakuum.
Als nächstes 0,83 Gramm Compound Drei und 20 Milliliter trockenes Dimethylsulfoxid in einen 50-Milliliter-Schlenkkolben geben und zwei Minuten rühren. Fügen Sie 0,22 Gramm Alpha-Omega-Diamin-Linker Compound 6 und 1,05 Milliliter N, N-Diisopropylethylamin und rühren Sie die Mischung unter Argon bei 90 Grad Celsius für 18 Stunden, um Homodimer 8 in einer dunkelgrünen Mischung zu erhalten. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen und in 100 Milliliter entionisiertes Wasser gießen.
Extrahieren Sie das Produkt in drei 50-Milliliter-Portionen Ethylacetat, kombinieren Sie die organischen Schichten und waschen Sie sie mit 50 Millilitern Wasser und Sole. Trocknen Sie die gewaschene organische Schicht über Natriumsulfat, filtern Sie das Trockenmittel heraus und entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum. Lösen Sie den Rückstand in einer minimalen Menge chromatographischen Lösungsmittels auf und tragen Sie ihn zur Reinigung auf eine Kieselgelsäule auf.
Sammeln Sie die fluoreszierenden Produktfraktionen, kombinieren Sie sie und entfernen Sie das Lösungsmittel, um Homodimer 8 als gelben Feststoff zu erhalten. Zu Beginn 2,28 Gramm Glutarimid 1 in 25 Milliliter Dimethylformamid in einem 100 Milliliter Rundkolben auflösen. 2,76 Gramm gemahlenes Kaliumcarbonat in dieser Lösung aussetzen.
Ziehen Sie dann 0,62 Milliliter Jodomeme in eine Spritze, die mit einer 20-Spur-Nadel ausgestattet ist. Fügen Sie das Jodometropfen im Laufe von 10 Sekunden hinzu. Stoppen Sie den Kolben mit einem Gummiseptum, und fügen Sie eine Entlüftungsnadel hinzu.
Beschallen Sie die Mischung für zwei Stunden bei Raumtemperatur, um Glutarimid-Compound 2 zu erhalten. Die Mischung mit 50 MilliliterEthylacetat verdünnen und in einen Trenntrichter gießen. Spülen Sie den Kolben mit weiteren 50 MilliliterEthylacetat in den Trichter.
Arbeiten Sie das Produkt auf und reinigen Sie es mit Kieselgel-Säulenchromatographie, um Glutarimid 2 als farblosen Festkörper zu erhalten. Vergleichen Sie die Retentionszeiten der Glutarimidverbindungen 1 und 2, um zu bestätigen, dass die N-Methylierung erfolgreich war. Um mit der Validierung zu beginnen, behandeln Sie mehrere Myelomzellen mit den von Interesse.
Isolieren Sie die relevanten Proteine und bereiten Sie Proben für eine Western Blot-Analyse des Proteinabbaus vor. Dann bereiten Sie ein Gel-Sandwich für SDS-PAGE vor und füllen Sie den Anodenpuffertank mit einer pH 8,9 Tris-HCl-Lösung. Die Proteinproben in das Gel laden und 20 Minuten lang bei 70 Volt laufen lassen, gefolgt von 115 Volt für 150 Minuten.
Als nächstes bereiten Sie 1x Transferpuffer für immunoblotting vor und bewegen Sie das Gel vorsichtig von seiner Kassette in den Transferpuffer, um es auszugleichen. Sie müssen sehr vorsichtig sein, wenn Sie das Gel aus der Kassette für die Gleichgewichtszeit entfernen, weil es sehr schnell platzen und zerbröckeln kann. Tauchen Sie eine 0,45 Mikrometer Polyvinylidendifluoridmembran für mindestens 20 Sekunden in reines Methanol ein, um sie zu aktivieren, und tauchen Sie sie dann in einen 1x Transferpuffer ein.
Lassen Sie das Gel und die Membran für 10 Minuten aussetzen. Dann montieren Sie die Western Blotting Kassette und wenden Sie 180 Milliampere für 90 Minuten an, um die Proteine auf die Membran zu übertragen. Anschließend visualisieren Sie die Proteine durch Immunfärbung.
Um die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, zuerst, Samen 50 000 multiple Myelom-Zellen pro Brunnen einer 96-Well-Platte in biologischer Triplicate. Fügen Sie zu jedem Brunnen 100 Mikroliter Medien, die DMSO enthalten, oder ein 0,1, ein oder 10 Mikromolar von Compound 8, Compound 9, oder Pomalidomid. Um ein Zelllebensrettungsexperiment durchzuführen, behandeln Sie stattdessen die Zellen mit einer 100-nanomolaren Lösung von Compound 8 für drei Stunden, entweder vor oder nach dem Hinzufügen einer mikromolaren Lösung von Pomalidomid.
Inkubieren Sie die Zellen für 24, 48 oder 96 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer 5%kohlendioxid-Atmosphäre, und messen Sie die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszierenden Assay. Die Struktur des homodimerischen PROTAC 8 wurde mit Proton und Kohlenstoff NMR bestätigt. Heterodimeric PROTAC 9 wurde als Negativkontrolle synthetisiert, da die N-Methylierung innerhalb des Glutarimid-Anteils zu einem Verlust der Bindungsfähigkeit von Cereblon oder CRBN führt.
Der Homo PROTAC 8 induzierte einen nahezu vollständigen proteosomalen CRBN-Abbau mit minimalen Auswirkungen auf die lymphoiden Transkriptionsfaktoren IKZF1 und IKZF3. Im Gegensatz dazu zeigte das Hetero PROTAC 9 ein ähnliches Verhalten wie Pomalidomide. Compound 8 induzierte CRBN Abbau könnte durch einen direkten Inhibitor des Proteasoms blockiert werden, oder indirekt durch NetylierungShemmung blockiert werden.
Mit Compound 8 vorbehandelte Zellen hielten den Auswirkungen von Pomalidomid auf IKZF1 und IKZF3 signifikant stand. Der zusammengesetzte 8-induzierte CRBN-Abbau hatte nach 96 Stunden viel weniger Einfluss auf die Lebensfähigkeit mehrerer Myelom-Zellals als der IKZF1- und IKZF3-Abbau von Compound 9 und Pomalidomid. Mehrere Myelomzellen, die mit Compound 8 vorbehandelt wurden, hatten eine signifikant größere Lebensfähigkeit, wenn sie Pomalidomid ausgesetzt waren als unbehandelte Zellen, was darauf hindeutet, dass Compound 8 verwendet werden könnte, um immunmodulatorische IMiD-Medikamentenresistenz zu imitieren.
Wir fanden heraus, dass Compound 8 den vollständigen proteasomalen Abbau von Cereblon induziert, keine Nebenwirkungen auf die Lebensfähigkeit und Proliferation von IKZF1- und IKZF3-Zellen hat. Die Ausweitung der Projekttechnologie auf andere Ziele hat das Potenzial zur Inaktivierung und Verfolgung von Proteinen im Zusammenhang mit Krebs und anderen Krankheiten. Bei der Anpassung dieser Technik für andere Medikamente und Proteine sollte man sorgfältig die molekularen Strukturen des Arzneimittels und das Proteinziel untersuchen, um die optimalen Linker und Anhänge zu wählen.
Die IMiDs funktionieren bei Mäusen aufgrund einer Punktmutation in Cereblon nicht, aber es gibt ein transgenes Knock-in-Maus-Modell, das für weitere Tierstudien verwendet werden kann. Da Pomalidomid ein analoges Thalidomid ist, das hoch teratogen ist, empfehlen wir schwangeren Frauen, die mit diesen Medikamenten arbeiten, nicht.
