Das hier beschriebene Protokoll liefert den Forschern eine Methode, um orale Neutrophile innerhalb eines ligaturinduzierten Tiermodells der Parodontitis analog zu menschlichen Teilnehmern zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik wird durch das erhöhte Volumen an entzündeten Zahnfleischgeweben hervorgehoben, das für die nachfolgende Analyse zur Verfügung steht, was den Tierischen Verbrauch reduziert. Unsere Fähigkeit, die biofilmbeschichteten Ligaturen aus der Umgebung der Zähne zu holen, ermöglicht die Simulation einer effektiven Behandlung einer lokalisierten Parodontitis.
Die Verwendung dieses Modells könnte bei der Untersuchung der systemischen Auswirkungen der Parodontitis in einem Tiermodell aufgrund der erhöhten Bereiche von entzündeten Zahnfleischgeweben angewendet werden. Die Vertrautheit mit dem Einsatz von mikrochirurgischen Instrumenten und Seziermikroskopen sowie das Binden von Chirurgenknoten vor dem Umgang mit lebenden Tiersubjekten wird stark empfohlen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, um die Länge der Lernkurve zu reduzieren, die erforderlich ist, um eine kompetente Ligaturplatzierung zu erreichen.
Demonstriert wird das Verfahren von Jeff Chadwig, einem Doktoranden aus meinem Labor. Beginnen Sie, indem Sie die Maus auf einer beheizten chirurgischen Plattform positionieren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Maus richtig beästhetisiert ist, stabilisieren Sie die Maxilla und den Unterkiefer in der offenen Position mit elastischen Bändern.
Stützen Sie den Hals mit einer Baumwollrolle, um die Maxilla in einer horizontalen Position zu halten und den Körper und Schwanz zu bedecken, um Wärmeverlust zu mildern. Positionieren Sie das Operationsmikroskop an der gewünschten Vergrößerung und Beleuchtung über der Mundhöhle. Verwenden Sie Splitterzangen, um eine sterile 50 oder kleinere geflochtene Seidennaht um die Kiefermuskeln M1 und M2 innerhalb des Zahnfleischsulkus zu installieren.
Positionieren Sie den distalen Schwanz der Naht auf der Gaumenseite des Gebisses und setzen Sie das proximale Segment zwischen dem Kontakt von M2 und M3 ein. Wickeln Sie es dann um die bukkale Oberfläche von M2 und legen Sie es zwischen den Kontakt von M1 und M2 ein. Stellen Sie sicher, dass beide Enden der Naht fest gezogen werden, um sie in den Zahnfleischsulkus zu treiben. Wickeln Sie das proximale Nahtsegment um M1 unter seiner Konturhöhe und legen Sie es zwischen den Kontakten von M1 und M2 ein. Ziehen Sie den proximalen Schwanz der Naht fest, um alle Hosen zu entfernen. Binden Sie die Enden der Naht mit einem Chirurgen Knoten und trimmen Sie die Schwänze so sortieren wie möglich.
Legen Sie den Knoten in die Zahnfleischumarmung zwischen M1 und M2 auf der Gaumenseite des Kieferhöhlens. Es ist wichtig, dass der Knoten, der verwendet wird, um die Ligatur zu sichern, sicher ist und in Position ist, wo er das Tier nicht reizen oder mit dem Mastix stören wird. Nach der Ligatur-Installation, entfernen Sie die Maus aus dem chirurgischen Gerät und legen Sie es in einen sauberen Käfig unter einer Wärmelampe, stellen Sie sicher, dass sie zu überwachen, bis vollständig erholt.
Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente in der heißen Glasperlensterilisator zwischen jedem Tier. Beherbergen Sie jede Maus mit der entsprechenden Umweltanreicherung und ermöglichen ad libitum Zugang zu gefiltertem Wasser und püriertem Standard-Chow in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung für sieben bis elf Tage. Wenn Sie bereit sind, Proben zu sammeln, verwenden Sie eine Pipette, um die Mundhöhle mit 100 Mikrolitersterilisierter vier Grad Celsius PBS ohne Kalzium und Magnesium für 10 Sekunden zu spülen.
Wiederholen Sie die Spülung zwei weitere Male, wobei jede Spülung in das gleiche 15 Milliliter konische sterile Reagenzglas für jedes Tier. Führen Sie den Inhalt jedes 15 Milliliter-Rohrs durch einen 40 Mikrometer Nylon-Netzfilter in ein 50 Milliliter konisches Rohr und übertragen Sie das Filtrat in ein neues 15 Milliliter-Reagenzglas. Fügen Sie 33,3 Mikroliter 16% Paraformaldehyd hinzu, um die Probenfixierung zu erleichtern.
Wirbeln Sie die Proben sofort und inkubieren Sie sie auf Eis für 15 Minuten. Paraformaldehyd ist das gefährlichste Reagenz, das im Protokoll verwendet wird, und sollte mit der empfohlenen persönlichen Schutzausrüstung behandelt werden, die vom Hersteller empfohlen wird. Nach der Inkubation das Rohr auf 15 Milliliter mit PBS füllen und dann bei 1000xg und vier Grad Celsius fünf Minuten zentrifugieren.
Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter FACS-Puffer bei vier Grad Celsius wieder auf und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler. Wiederholen Sie die Zentrifugation und aspirieren Sie den Überstand. Dann setzen Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen von FACS-Puffer für eine Endkonzentration von 500, 000 bis 1 Million Zellen pro 50 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf und übertragen die Zellen in das FACS-Rohr.
Fügen Sie einen Mikroliter Rattenserum und zwei Mikroliter Anti-Maus-IGG-Antikörper zu 50 Mikrolitern der Probe hinzu. Wirbeln Sie die Probe sofort und blockieren Sie sie für 20 Minuten auf Eis. Fügen Sie dann die entsprechenden Antikörper zu jeder Probe hinzu.
Wirbel und inkubieren auf Eis für 30 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Proben nach der Inkubation mit einem Milliliter FACS-Puffer, Wirbel kurz und Zentrifuge für fünf Minuten bei 1000xg und vier Grad Celsius. Dump den Überstand und verblocke vorsichtig die Öffnung des FACS-Rohrs.
Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, und setzen Sie die Proben dann in 250 Mikroliter FACS-Puffer zur Lagerung wieder auf. Bedecken Sie die Rohre mit Paraffinfolie, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit sind. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um Neutrophile zu analysieren, die von einer oralen Spülung einer naiven Maus erholt wurden, sowie eine orale Spülung und wiedergewonnene Ligatur von einer Maus mit Ligatur-induzierter Parodontitis.
Zur Beurteilung des Alveolarknochenverlustes wurden alveolare Knochenwerte vom Alveolarknochenkamm bis zur Zementoenamel-Kreuzung für gesunde und ligaierte Mäuse gemessen. Anschließend wurden die Messdifferenzen berechnet. Obwohl hier nicht überprüft, kann auch die histopathologische, immunhistochemische und morphometrische Bewertung des Parodontiums und des Alveolarknochens je nach Forschungsfrage durchgeführt werden.
Dieses Modell wird derzeit in meinem Labor verwendet, um die Auswirkungen des oralen angeborenen Immunsystems auf systemische Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.
