Diese Methode kann die Aktivität von Retrotranspositionen namens LINE-1s erkennen. Diese mobilen genetischen Elemente verursachen de novo Insertionen in Krebsgenome und tragen dadurch zur genomischen Instabilität bei. Der Vorteil dieser PCR-basierten Technik ist, dass sie im Vergleich zu Sequenzierungsansätzen mit hohem Durchsatz einfach und kostengünstig ist.
Wir zeigen hier seinen Nutzen beim Nachweis von de novo Insertionen, die von einer LINE-1 innerhalb des TTC28-Gens auf dem menschlichen Chromosom 22 stammen. LINE-1-Aktivität kann als Biomarker für Malignität oder Prämalignität dienen, insbesondere bei epitheliaden Tumortypen, wie Dickdarmkrebs oder hochwertigem serösen Eierstockkrebs. Neben LINE-1-Einfügungen kann diese Methode auch andere genomische Aberrationen erkennen, wie z. B. DNA-Umlagerungen, die aus einem Grund immer neu arrangiert werden müssen.
Um ein geeignetes Restriktionsenzym auszuwählen und inverse Primer zu entwerfen, laden Sie zunächst die SEQUENZ TTC28 LINE-1 im FASTA-Format aus einer LINE-1-Datenbank wie L1Base herunter. Die L1Base ID für TTC28 Line-1 ist 135. Schließen Sie fünf Kilobases-Sequenz, flankieren sowohl fünf Prime und drei Prime, Ende der Line-1-Sequenz.
Exportieren Sie die Sequenz in einen Textverarbeitungsprogramm. Hier wird die Line-1 Flankenfolge in brauner Schrift und Line-1-Sequenzen in grauer Schrift mit Anmerkungen angezeigt. Um das eindeutige Tag in einer Kilobasissequenz nach dem drei Primzahlwert von TTC28 Line-1 und in einem der Polyadenylierungssignalvorhersagetools wie Polyadq oder Dragon PolyA Spotter zu bestimmen.
Kommentieren Sie alle Polyadenylierungssignale in diesem 1-Kilobase-Fenster. Die Sequenz zwischen dem hier in Rosa hervorgehobenen schwachen Polyadenylationssignal von TTC28 LINE-1 und dem stärksten Polyadenylierungssignal nachgeschaltet ist das einzigartige Tag dieser LINE-1, die hier gelb hervorgehoben ist. Um inverse PCR-Primer zu entwerfen, geben Sie die eindeutige Tag-Sequenz in ein webbasiertes Primer-Design-Tool ein, wie z. B. NCBi es Primer-BLAST, das bestimmte PCR-Primer generiert, den Parameter für die Produktlänge auf ein Minimum zu beschränken, um zu zeigen, dass Primerpaare nahe beieinander liegen.
Wählen Sie die entsprechende Genomdatenbank aus. Da der Ausgang von Primer Blast herkömmliche PCR-Primer erzeugt, die einander gegenüberstehen, verwenden Sie die Reverse-Komplement-Funktion für das Primer-Paar, um inverse PCR auszuführen. Inter-Design-Primer, entsprechend dem Ostpolyadenylierungssignal, wann immer möglich.
Wir haben drei Primerpaare, hervorgehoben in Petrol und Grün, entsprechend drei starken Polyadenylierungssignalen im einzigartigen Tag von TTC28 LINE-1 deigned. Um als Nächstes ein geeignetes Restriktionsenzym auszuwählen, verdauen Sie die LINE-1-Sequenz zusammen mit ihren fünf Kilobase-Vor- und Nachflussflanken in Kieselsäure mit webbasierten Werkzeugen wie RestrictionMapper. Dies wird eine umfassende Liste von Restriktionsenzymen geben, die diesen Grund verdaut und verschiedene Restriktionsfragmente erzeugt.
Wählen Sie Restriktionsenzyme aus, die eine fünf Primzahl vor dem fünf Prim-Ende von LINE-1 oder in Richtung des fünf Prim-Endes der LINE-1 machen, wenn sie sich innerhalb der LINE-1 selbst befindet. Und eine drei Prime-Karte nach dem einzigartigen Tag. Das native Restriktionsfragment mit der LINE-1-Sequenz und seinem einzigartigen Tag, das durch selektive Restriktionsenzyme hergestellt wird, sollte nicht länger als 12 Kilobasen sein, da es möglicherweise nicht effizient durch PCR verstärkt wird.
Beachten Sie, dass die selektiven Restriktionsenzyme unempfindlich gegen DNA-Methylierung wären, hitzeinaktivierbar sein und klebrige Enden erzeugen sollten, die sich gegenseitig ergänzen. Um die inverse PCR über die Ferne zu demonstrieren, verwenden wir das SacI-Restriktionsenzym, das DIE DNA an DAZCTC-Standorten schneidet, die hier in hellgrün hervorgehoben sind. SacI erfüllt alle Kriterien am TTC28 LINE-1-Standort und erzeugt ein natives Restriktionsfragment von 5. 700 Basenpaaren.
Extrahieren Sie genomische DNA aus Proben mit kommerziell erhältlichem DNA-Extraktionskit, das in der Lage ist, qualitativ hochwertige, hochmolekulare DNA zu extrahieren, die für die inverse PCR über große Entfernungen erforderlich ist. Hier haben wir genomische DNA aus MCF7 Brustkrebs-Zelllinie und normales menschliches Blut mit Anleitung der Herstellung extrahiert. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.
100 Hundert Nanogramm DNA auf einer Person Agarose Gel neben einem DNA-Molekulargewichtsmarker, um DNA-Qualität und -Menge zu überprüfen. Um kreisförmige DNA-Vorlagen zu erstellen, verdauen Sie zuerst die DNA mit geeignetem Restriktionsenzym. Hier verwenden wir SacI, um MCF7 und Blutgenom-DNA zu verdauen Machen Sie einen Verdauungsreaktionsmix nach Textprotokoll.
Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr und die Zentrifuge kurz streichen. Inkubieren Sie den Reaktionsmix bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, gefolgt von einer Wärmeinaktivierung, wie der Hersteller angibt. Als nächstes machen Sie eine Ligation Reaktion Sitten-Master-Mix-Lösung nach dem Textprotokoll, um die verdaute DNA selbst zu ligan.
Fügen Sie für jede Reaktion 30 Mikroliter dieses Ligationsreaktionsmasters direkt zu 50 Mikrolitern verdauter DNA-Lösung aus dem vorherigen Schritt hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr und Zentrifuge das Rohr kurz. Inkubieren Sie diese Reaktionsmischung in einem thermischen Cycler bei 22 Grad Celsius für 10 Minuten und beenden Sie mit einem Wärmeinaktivierungsschritt bei 60 Grad Celsius für weitere 10 Minuten.
Diese kreisförmige DNA-Vorlage wird in einem nachfolgenden inversen PCR-Schritt verwendet. Legen Sie einen Glühtemperaturgradienten in einem thermischen Cycler fest, um die optimale Grundierungstemperatur anhand der Gradienten-PCR zu bestimmen. Bereiten Sie einen Master-Mix für die PCR vor, indem Sie alle Komponenten entsprechend dem Textprotokoll kombinieren und mischen.
Richten Sie eine Reaktion für jede Glühtemperatur im Gradienten ein. Weisen Sie für jede Reaktion 19 Mikroliter der Master-Mix-PCR-Röhren zu und fügen Sie einen Mikroliter kreisförmiger DNA-Vorlage hinzu, die aus der genomischen Dna des Blutes generiert wird. Führen Sie das Gradienten-PCR-Programm aus.
Führen Sie sechs Mikroliter PCR-Produkt, erhitzen Sie es bei unterschiedlicher Glühtemperatur in einem Gang in Agarose-Gel. Um de novo TTC28 LINE-1 Retrotranspositionsaktivität im Genom der MCF7-Zelllinie zu erkennen, führen Sie PCR mit inversen Primerpaar auf kreisförmigen DNA-Vorlagen, die aus MCF-7-Zelllinie generiert werden. Befolgen Sie die gleichen Anweisungen wie für GradientPCR, aber dieses Mal ersetzen Sie den Temperaturgradienten mit optimalen Glühtemperatur, die 64 Grad Celsius beträgt.
Analysieren Sie die inversen PCR-Produkte über lange Entfernungen mit Agarose-Gel für die Ergebnisse. Dieses Agarose-Gel-Bild, das nach einer Elektrophorese aufgenommen wurde, zeigt die genomische DNA, die aus MCF7 extrahiert wurde, und Blutproben haben ein hohes Molekulargewicht, wodurch es für inverse CPCR über große Entfernungen geeignet ist. Dieses Agarose-Gel-Bild, das nach Elektrophoresen aufgenommen wurde, zeigt, dass das von uns entworfene inverse Primerpaar die richtige kreisförmige Schablone bei allen Glühtemperaturen im Gradienten verstärkt, wie es bei einer intensiven Spanne zwischen 5 Kilobase und sieben Kilobase-DNA-Marker beobachtet wird.
Allerdings werden auch verschiedene Bänder bei niedrigeren Temperaturen beobachtet, was auf eine schlechte Grundierungsspezifität und schlechte Glühtemperaturen hindeutet. Somit ist für dieses Primerpaar 64 Grad Celsius die optimale Glühtemperatur. Dieses Agarose-Gel-Bild zeigt das PCR-Produkt, das nach der Durchführung von inverser Langstrecken-PCR auf DNA aus MCF7-Zelllinie und normalem Blut erhalten wurde.
Ein PCF-Produkt von 5. 700 Basenpaaren, gekennzeichnet durch ein Sternchen, stellt die native PCR dar, die Line-1 an ihrem nativen Ort entspricht. Dieses native PCR-Produkt ist sowohl in MCF7 als auch in normaler Blut-DNA sichtbar. De novo LINE-1 Retrotransposition und MCF7 Genom ist nachweisbar als PCR-Produkt in verschiedenen Größen, zusammen mit nativen PCR-Produkt im Agaro-Gel.
Die Sequenzierung des inversen PCR-Produkts über die Ferne durch einmolekulare Langlese-Sequenzierungstechnologien kann die Identifizierung von Zielidentifikationen in einer kernkraftigen Auflösung ermöglichen. Obwohl ein umständlicher Ansatz, Klonen und Sanger-Sequenzierung des Langstrecken-InversePCR-Produkts ist auch möglich. In diesem Video wurde die Aktivität einer LINE-1 auf Chromosom 22 erkannt.
Derselbe Workflow kann angepasst werden, um andere LINE-1s zu überwachen, die in verschiedenen Tumortypen aktiv sind.
