Dies ist eine neuartige Methode zur Beurteilung des Glukokortikoidhormons Cortisol aus Koalafell. Es bietet einen neuartigen Biomarker für die Beurteilung von chronischem Stress in Koalas. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine hochempfindliche und reproduzierbare Methode mit einer ziemlich schnellen Bearbeitungszeit zwischen Probenvorbereitung und Hormontest handelt.
Diese Technik ermöglicht die quantitative Bewertung von chronischem Stress in Koalas, das ein sehr nützliches klinisches Management-Tool ist. Dylan Fox, ein Grad-Student aus meinem Labor, hilft mir bei diesem Verfahren. Um dieses Verfahren zu beginnen, holen Sie das Fell aus dem Lager bei minus 80 Grad Celsius und lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen.
Dann wiegen Sie das Fell auf einem Labor analytische Präzisionsbalance. 60 Milligramm des Fells in ein vorgewogenes und beschriftetes 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben und wiederholen, bis 18 Tuben gefüllt sind. Mit einer Pipette, fügen Sie einen Milliliter von 100%HPLC Grad Isopropanol zu jedem Rohr.
Wirbeln Sie die Proben für 30 Sekunden. Jede Probe mit einem 0,5-Milliliter-Mikropräzisionssieb abseihen, um flüssigkeits- und pelzlösenzukönnen, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einen Abfallbehälter. Legen Sie jede Fellprobe in ein beschriftetes Kunststoff-Wägeboot.
Dann legen Sie die Wägeboote in einen Vakuum-Austrocknungsgerät und lassen Sie für drei Tage das Fell trocknen. Sobald das Fell vollständig trocken ist, legen Sie jede Probe in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Jede Probe in eine Perlenmühle mit drei Chrom-Stahlperlen geben und zwei Minuten bei 30 Shakes pro Sekunde pulverisieren.
Wiederholen Sie diesen Transfer mit 100% analytischem Methanol und 100% analytischem Isopropanol, bis 18 Gesamtrohre gefüllt wurden. Danach verwenden Sie eine Pipette, um einen Milliliter der ersten Extraktionstechnik in sechs 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren zu übertragen, die die Fellprobe enthalten. Verkapseln Sie jedes Rohr und verwenden Sie einen Shaker, um sie bei Raumtemperatur mit konstantem Pulsieren für mindestens 12 Stunden zu bebrüten.
Dann die Proben mit einem 0,5-Milliliter Mikropräzisionssieb abseihen. Verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit in ein neues beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr zu übertragen, während Sie sicherstellen, dass das Fell entsprechend entsorgt wird. In einer Dunstabzugshaube den Lösungsmittelextrakt unter einem Stickstoffdampfstrom vollständig ausprobieren.
Rekonstituieren Sie dann die getrocknete Probe mit 400 Mikroliter Assaypuffer und 100 Mikrolitern Ethanol in analytischer Qualität. Um die Kontrollen durchzuführen, wählen Sie zunächst Proben von Tieren mit bekannter Exposition gegenüber dem Stressor aus. Um einen Extraktpool zu bilden, nehmen Sie 20 Mikroliter Extrakt aus jeder Probe, bis ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern erhalten ist.
Bewahren Sie den Extraktpool bei minus 80 Grad Celsius auf, bis er bereit ist, Assays auszuführen. Wenn Sie bereit sind, erhalten Sie den Verdünnungsfaktor für die 30% und 70%-Bindungspunkte aus dem Parallelitätsdiagramm für den Extrakt mit dem Cortisolstandard, und verwenden Sie den Assaypuffer, um den Probenpool entsprechend zu verdünnen, um die hohen und niedrigen Kontrollen zu erstellen. Mit einem kommerziellen Cortisol-Kit eine 96-Well-Bandplatte mit den Proben, Kontrollen, Cortisol-Standards, unspezifisch bindenden Brunnen und maximal bindenden Brunnen nach den Anweisungen des Lieferanten einrichten.
Verwenden Sie das im Kit-Booklet enthaltene Plattenlayoutblatt, um die Positionen der Proben, Steuerelemente und Standards aufzulisten. Als nächstes folgen Sie dem zuvor beschriebenen Pelzhormonextraktionsprozess, um 100% Methanol-extrahiertes Koalafell zu erhalten. Bereiten Sie die Reagenzien des Cortisol-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
Pipette 50 Mikroliter Proben oder Standards in die Brunnen der Platte. Pipette 75 Mikroliter Assaypuffer in die unspezifisch bindenden Brunnen und 50 Mikroliter Assaypuffer in die maximal bindenden Brunnen. Mit einer Repeaterpipette fügen Sie 25 Mikroliter des Cortisol-Konjugats zu jedem Brunnen hinzu.
Dann Pipette 25 Mikroliter des Cortisol-Antikörpers in jeden Brunnen, mit Ausnahme der unspezifisch bindenden Brunnen. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die Reagenzien gut gemischt sind. Bedecken Sie die Platte mit dem Plattenversiegeler, und verwenden Sie einen Orbital-Shaker, um bei Raumtemperatur für eine Stunde zu schütteln.
Danach entfernen Sie die Plattendichtung und saugen Sie die Brunnenplatte an, indem Sie jeden Brunnen mit 300 Mikroliter Waschpuffer viermal waschen. Trocknen Sie dann die Platte, indem Sie sie auf saubere saugfähige Handtücher tippen. Pipette 100 Mikroliter Tetramethylbenzidinsubstrat zu jedem Brunnen.
Legen Sie die Plattenversiegelung auf die Brunnenplatte und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Danach Pipette 50 Mikroliter Stop-Lösung in jedem Brunnen. Übertragen Sie die Platte in einen Plattenleser, der 450 Nanometer lesen kann, und berechnen Sie die endgültige Hormonkonzentration, wie im Textprotokoll beschrieben.
In dieser Studie wird der Aufsatznachweis von Hormonmetaboliten von Interesse durch Parallelität bestimmt. In der Parallelitätskurve bestimmt der 50%-Bindungspunkt den Probenverdünnungsfaktor auf der Standardkurve. Wie man sieht, lieferten die 100%ethanol- und 100%isopropanol-Extrakte keine parallele Verschiebung gegenüber dem Cortisol-Standard.
Der 100%methanol-Extrakt bietet jedoch eine parallele Verschiebung gegenüber dem Cortisol-Standard. Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten werden aus hoch- und niedrigbindenden Probenextrakten bestimmt, die in allen Assays ausgeführt werden. Die niedrigverbindlichen internen Kontrollen gelten als ordentlicher Koala-Extrakt-Pool, während die hochverbindlichen internen Kontrollen als eins-zu-zwei verdünnter Koala-Extrakt-Pool angesehen werden.
Die Assoziation zwischen jedem Lösungsmittelextrakt und dem Cortisolstandard wird dann mittels eines Regressionsdiagramms bestimmt. Der 100%methanol-Extrakt bietet die beste Regressionslinie mit dem höchsten R-Quadrat-Wert im Vergleich zu den 100% Ethanol- und 100%isopropanol-Extrakten. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass die Probe Waschschritt vor dem Schleifen der Proben durchgeführt werden muss, um den Verlust von Steroidhormonen zu vermeiden.
Nach diesem Verfahren können wir andere steroidale Hormone messen, wie Fortpflanzungshormone, um die Wechselwirkungen zwischen Stress und Fortpflanzung in Koalas zu betrachten. Diese Technik bietet ein neues Werkzeug für das aufkommende Gebiet der Erhaltungsphysiologie, das die nicht-invasive Beurteilung von Cortisol in Koalafellermöglicht. Das kommerzielle Cortisol-Kit liefert Reagenzien in winziger Menge.
Es ist jedoch wichtig, persönliche Schutzausrüstung zu tragen, um Verletzungen an sich selbst zu minimieren, während Sie dieses Laborverfahren durchführen.
