Unser Protokoll bietet sowohl in vivo- als auch ex vivo-Maßnahmen zur Visualisierung und Charakterisierung der hyaloiden Vaskulatur im Auge als nützliches experimentelles Modell zur Untersuchung der vaskulären Regression. Diese Technik kombiniert sowohl in vivo Längsbeobachtung von Hyaloidgefäßen in lebenden Mäusen als auch ex vivo Visualisierung und genaue Quantifizierung von sezierten ganzen Hyaloidgefäßen. Unsere Technik bietet eine praktische und praktikable Methode zur Untersuchung der Pathogenese und der grundlegenden Mechanismen der persistenten fetalen Vaskulatur.
Diese Methode bietet auch Einblicke in zelluläre und molekulare Mechanismen, die an der Regulation der okularen Gefäßregression beteiligt sind, die für die Angiogeneseforschung in anderen Organen relevant sein können. Die Hyaloid-Isolationsschritte können für Anfänger technisch eine Herausforderung darstellen. Viel Übung und Geduld werden dazu beitragen, eine erfolgreiche Sektion zu gewährleisten.
Die Visualisierung dieser Methode bietet detaillierte praktische Informationen und Tipps zur Technik, die den Betrachtern dabei helfen kann, die Fähigkeiten effizienter zu beherrschen. Passen Sie für die optische Kohärenztomographie oder OCT-Bildgebung die Maus und die Sonde so an, dass sich der optische Nervenkopf in der Mitte des Gesichtsfeldes im Fundusbild befindet, und passen Sie den Fokus und den Winkel der angegebenen Linie in der OCT-Bildgebungssoftware an, um die persistenten Hyaloidgefäße zu enthüllen, bevor Sie Bilder erhalten. Passen Sie bei der Fundusfluorescein-Angiographie der Hyaloidgefäße die Ausrichtung leicht an, um den Sehnervenkopf in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren, und ändern Sie den Mikroskopfilter in einen grünen Fluoreszenzkanal.
Konzentrieren Sie sich dann auf die persistenten Hyaloidgefäße und erhalten Sie mehrere Bilder bei einer, drei, fünf und 10 Minuten nach der Injektion, um den besten Zeitpunkt für das Signal-Hintergrund-Verhältnis für die Beobachtung der Gefäße zu bestimmen. Für ex vivo hyaloid Gefäßsektion und Visualisierung verwenden Mikrochirurgie Zangen, um die Augenlider einer postnatalen Tag-acht-Maus zu öffnen und bogenförmige Mikrochirurgie Zangen unter dem Globus in der Umlaufbahn eines Auges zu platzieren, um den Sehnerv zu greifen, ohne den Augapfel zu drücken. Ziehen und entfernen Sie den Augapfel vorsichtig mit Zangen und fixieren Sie das Auge in 4%Paraformaldehyd bei Raumtemperatur.
Nach 30 Minuten die fixierten Augäpfel unter einem Seziermikroskop auf eiskaltes PBS übertragen und 50 Mikroliter Gelatinelösung in den Glaskörper des Augapfels an vier verschiedenen gleichmäßig verteilten Stellen um den Limbus injizieren. Dann bebrüten Sie den Augapfel für 30 Minuten auf Eis, um die injizierte Gelatine im Glaskörperraum zu erstarren. Wenn die Gelatine ausgehärtet hat, übertragen Sie den Augapfel auf eine Petrischale von PBS unter dem Sezieren Mikroskop und verwenden Sie Mikrochirurgie-Schere, um einen Schnitt am Limbus zu machen, um die Hornhaut zu entfernen.
Schnippen und entfernen Sie den Sehnerv unter dem Sezieren des Mikroskops. Mit zwei Paarzangen abziehen und entsorgen die Sklera, Aderhaut und retinale Pigment epithel schichten, gefolgt von der Entfernung der Iris. Mit der Sehnervseite der Netzhaut nach oben und den Linsen nach unten, injizieren 50 Mikroliter PBS direkt unter der Netzhauttasse, um die Ansammlung der PBS zwischen dem gelatinierten Glaskörper und der Netzhaut zu ermöglichen.
Verwenden Sie Mikrochirurgie Zangen, um die Netzhaut Tasse und Ziliarkörper sanft aus dem Glaskörper zu schälen. Übertragen Sie mit einer Transferpipetten den Gelatinenbecher mit dem in PBS eingetauchten Hyaloidgewebe auf ein Mikroskopschlitten. Und drehen Sie die restlichen Gewebe um, so dass die Linse nach oben gerichtet ist.
Dann heben Sie die Linse und lockern Sie sanft die Verbindung zwischen der Linse tunica vasculosa lentis und der Vasa hyaloidea propria, bevor Sie die Hyaloidarterie mit der Mikrochirurgieschere schneiden, um die Linse Tunica vasculosa lentis zu entfernen. Bewahren Sie die Vasa hyaloidea propria Region des Hyaloidbechers für die flache Halterung auf. Für die flache Montage des Hyaloidgefäßes spülen Proben den Hyaloidbecher vorsichtig mit frischem PBS ab, um zerseten Schmutz zu entfernen.
Mit dem in PBS schwebenden Gewebe verwenden Mikrochirurgie Zangen, um die Position des gelatinierten Hyaloidbechers sanft anzuordnen und anzupassen, so dass der Rand des Bechers nach unten gerichtet ist. Legen Sie die Rutsche mit dem in PBS eingetauchten Hyaloidbecher auf einen Gleitwärmer bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Gelatine schmilzt und die Hyaloidabflachungen entfernen Sie die Rutsche, wenn es kaum trocken ist und fügen Sie einen Tropfen Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI, um die Kerne in den Hyaloidgefäßen zu färben.
Legen Sie dann vorsichtig einen Deckelrutsch auf das Hyaloid, um die flache Halterung zu vervollständigen. Um die DAPI-Färbung der Hyaloidgefäße abzubilden, wird die montierte Probe auf die Bühne eines Fluoreszenzmikroskops übertragen und bestätigen, dass die zentrale Hyaloidarterie sichtbar ist. Identifizieren Sie dann die Gefäßzweige, die direkt von der Hyaloidarterie abgeleitet sind, und zählen Sie manuell die Anzahl der Gefäßzweige für die Quantifizierung.
Hier werden Querschnittsansichten von OCT-Bildern für die Netzhaut und Hyaloidgewebe in drei Monate altem Wildtyp und low-density Lipoprotein-Rezeptor-bezogenen Protein enoder oder LRP5 Knockout-Mäusen, einem Tiermodell mit persistenten Hyaloidgefäßen, gezeigt. In diesen Fundus fluorescein angiography werden Bilder von persistenten Hyaloidgefäßen acht Zweige von Hyaloidgefäßen im Glaskörper von sechs Wochen alten Knockout-Mäusen beobachtet, während bei wildlebenden Tieren des gleichen Alters kein Überbleibsel der Hyaloidgefäße beobachtet wird. In diesen hyaloiden Gefäß-Flach-Mounts können die Gefäßzellen und die zugehörigen Makrophagen durch ihre nukleare DAPI-Färbung identifiziert werden.
Und jede Zelllinie, die sich von der zentralen Hyaloidarterie verzweigt, stellt ein Gefäß der Vasa hyaloidea propria dar. Wildtyp-Mäuse haben durchschnittlich 12 Zweige von Hyaloidgefäßen am postnatalen Tag acht, während altersgerechte LRP5-Knockout-Welpen etwa 25 Zweige von Hyaloidgefäßen aufweisen, die eine signifikant beeinträchtigte Regression der Hyaloidvaskulatur zeigen. Darüber hinaus wird eine verzögerte und unvollständige Retina-Gefäßentwicklung auch bei LRP5 Knockout Welpen beobachtet.
Tatsächlich können Hyaloidgefäße noch in Querschnitten von LRP5-Knockout-Augengewebeabschnitten am postnatalen Tag acht identifiziert werden. Während die wilden Typ augen diese Gefäße nicht mehr zeigen. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, sanft und geduldig zu sein, wenn man das Hyaloidsystem von der Netzhaut und anderen Augengeweben isoliert.
Nach der Isolierung der Hyaloidgefäße kann eine Immunfärbung mit verschiedenen Zellmarkern durchgeführt werden, um die zellulären Wechselwirkungen aufzudecken, die die Hyaloid-Regression regulieren. Diese Technik untersucht die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen der persistenten fetalen Vaskulatur in der okulären Angiogeneseforschung. Paraformaldehyd, Ketamin und Xylazin sind gefährlich.
Bitte bereiten Sie diese Reagenzien in einer chemischen Rauchhaube mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung vor.
