Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung eines orthotopen Mausmodells von Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Verwendung eines Systems, das die Injektion von Zellen und die Bewertung der Anpflanzung und Entwicklung von Tumoren kombiniert. Diese Technik hat eine hohe Reproduzierbarkeit, ist minimalinvasiv, ermöglicht es, viele durch den chirurgischen Eingriff verursachte Nachteile zu überwinden und entspricht den 3R-Prinzipien. Die echogeführte Injektion könnte für andere orthotopische Modelle verwendet werden, wie z.B. Injektionen in den Gallenbaum oder Brustkrebsmodelle.
Die Verwendung einer solchen Technik könnte mit der Verwendung kleiner Moleküle gekoppelt werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer 8 Wochen alten 20 Athymic Nude-Foxn-1nu weiblichen Mäuse für die ultraschallgesteuerte Injektion, indem Sie Tramadol intraperitoneal in einer Dosis von 5 Milligramm pro Kilogramm mit einer Tuberkulinspritze mit einer 27-Gauge-Nadel verabreichen. Schalten Sie anschließend den Imager ein und wählen Sie "Maus, Klein, Bauch" im Anwendungsmenü des Wandlerbereichs.
Stellen Sie sicher, dass das Fenster B-Modus oder Helligkeitsmodus angezeigt wird und das System bereit ist, B-Mode-Daten zu erfassen. Wechseln Sie zum Studienbrowser, um "Neue Studie" auszuwählen, und geben Sie den Studiennamen und die Informationen ein, z. B. das Datum der Studie. Geben Sie dann alle notwendigen Informationen im Seriennamen ein, z. B. Tierstamm, ID, Geburtsdatum.
Nachdem die Informationen eingegeben wurden, tippen Sie auf "Fertig", um das Programm für die B-Mode-Bildgebung vorzubereiten. Legen Sie die betäubte Maus auf der rechten Flanke mit der Schnauze in einem Nasenkegel auf den bei 37 Grad Celsius erhitzten Handlingtisch und tragen Sie einen Tropfen Tierarztsalbe auf die Augen der Maus auf. Verwenden Sie dann eine Klebegaze, um die rechte Hand, den rechten Fuß und den Schwanz der Maus auf die Elektrodenpads auf der Tierplattform zu kleben.
Die Atemfrequenz der Maus und das Elektrokardiogramm werden über die Elektrodenpads aufgezeichnet. Bevor Sie der Maus PANC1-Zellen injizieren, desinfizieren Sie die Maushaut mit 70% Ethanol und halten Sie die Haut der linken Flanke mit Klebegaze gestreckt. Verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze ohne Nadel, um Ultraschallgel auf den Bauch und die linke Flanke der Maus aufzutragen.
Mit Hilfe des Höhenreglers des Ultraschallwandlers senken Sie den Schallkopf, um die linke Flanke der Maus zu berühren, und platzieren Sie den Schallkopf quer zum Körper des Tieres. Bewegen Sie dann den Schallkopf, um die Bauchspeicheldrüse auf dem Display des Schallkopfes mithilfe der B-Mode-Bildgebung zu visualisieren. Bereiten Sie eine 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit 10 Millionen PANC1-Zellen vor, die in 20 Mikrolitern PBS suspendiert sind, mit einer desinfizierten 30-Millimeter-Nadel mit 28 Gauge und legen Sie die Spritze auf den entsprechenden Halter.
Senken Sie die Spritze mit dem Mikromanipulator des Halters auf die Maushaut, wobei die Nadelabschrägung nach oben und in der gleichen Ebene wie der Ultraschallwandler liegt und einen Winkel von 45 Grad mit dem Schallkopf bildet. Perforieren Sie die Haut mit dem Mikromanipulator und führen Sie die Spritzennadel in die Bauchspeicheldrüse ein, während Sie das angezeigte Ultraschallbild beobachten, um der Flugbahn zu folgen. Sobald die Nadel in die Bauchspeicheldrüse eingeführt wurde, injizieren Sie einen 20-Mikroliter-Bolus, der die Zellen enthält, indem Sie konstanten Druck auf den Kolben der Spritze ausüben.
Das richtige Injektionsverfahren kann durch das Vorhandensein einer kleinen Blase in der Bauchspeicheldrüse und den Fluss von hypoechogener Flüssigkeit überprüft werden. Nach 5 bis 10 Sekunden der Injektion ziehen Sie die Nadel zurück. Entfernen Sie dann den Ultraschallwandler und reinigen Sie das Gel von der Flanke.
Wenn Sie fertig sind, setzen Sie die Maus allein in einen neuen Käfig unter Beobachtung, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Das repräsentative Bild zeigt das Vorhandensein einer Tumormasse im Schwanz der Bauchspeicheldrüse nach echogesteuerter Zellinjektion, was die Reproduzierbarkeit des Protokolls bestätigt. Das Tumorvolumen von orthotopen Pankreastumoren, die aus PANC1-Zellen gewonnen wurden, wurde einmal wöchentlich durch Ultraschallbildgebung bewertet, beginnend mit Tag 8 nach der Zellinjektion.
Am Endpunkt des Experiments an Tag 43 wurden Ultraschallbilder der Tumormassen aufgenommen. Bei der Nekropsieuntersuchung wurde Tumormasse, ein kleiner Teil einer gesunden Bauchspeicheldrüse, Milz, Magen und Leber beobachtet. Zusätzlich wurden die Tumormassen für die histologische Analyse explantiert.
Es ist wichtig, die Maus auf der rechten Seite auf dem Tisch zu positionieren, und die Haut muss richtig gedehnt werden, um das Risiko zu vermeiden, dass die Zellen aus der Bauchspeicheldrüse auslaufen. Zukünftige Anwendungen des Bauchspeicheldrüsenkrebsmodells, das durch die ultraschallgesteuerte Injektion gewonnen wird, umfassen die Studien zur Entwicklung geeigneter therapeutischer Behandlungen oder Behandlungskombinationen.
