Ziel dieses Protokolls ist es, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Zellen zu visualisieren. Um dies zu erreichen, verwenden wir Polytenzellen, die sich in den Speicheldrüsen dritter Instar-Larven befinden Das Genom dieser Zellen wird fast tausendfach amplifiziert, und die Chromosomen erhalten die Eigenschaften von Grenzflächenzellen. Sie haben gut definierte Telomere und Brücken, die Chromozentrum genannt werden, in denen sich alle Zentromere aggregieren, und es ist hauptsächlich heterochromatisch.
Mit dem dritten Instar-Larvengewebe können wir auch die Veränderung der heterochromatischen Aggregate im Hintergrund verschiedener genetischer Mutanten bewerten. Um die dritte Instar-Larvenkultur zu optimieren, müssen Sie zuerst 5 bis 10 Tage alte Erwachsene sammeln und etwa 50 in eine breite Halsflasche eines Standardmediums geben. 25 männlich und 25 weiblich.
Stellen Sie die Flasche für 12 Stunden in einen Inkubator mit kontrollierter Temperatur bei 25 Grad Celsius. Nachdem die Inkubationszeit vorbei ist, entfernen Sie die Erwachsenen und übertragen Sie sie in eine neue Flasche, um den Vorgang zu wiederholen. Lassen Sie die Embryonen 22 Stunden lang bei 18 Grad Celsius wachsen.
Stellen Sie für die Larvensammlung sicher, dass Sie die wandernden Larven wählen, die keine unverschämten Kugeln haben. Sezieren Sie 15 Paar Speicheldrüsen oder so viel wie möglich in 30 Minuten bei kaltem PBS mit Protesthemmern unter dem Mikroskop. Übertragen Sie die Speicheldrüsen in ein anderes Rohr mit eiskaltem PBS.
Einmal mit kaltem PBS plus Protesthemmern waschen. Denken Sie daran, warten Sie immer, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat. Nachdem Sie das PBS aus dem letzten Schritt entfernt haben, fügen Sie direkt 0,5 Milliliter eines Kaugummifixierungspuffers der X-Gruppe und 50% Methanol plus 2% Formaldehyd hinzu.
Zwei Stunden bei vier Grad Celsius bei milder Rotation inkubieren. Führen Sie eine fünfminütige Rotationswäsche mit Tris-Triton-Puffer durch und fügen Sie einen Milliliter hinzu. Warten Sie immer, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat.
Hinweis: Warten Sie, bis das Gewebe den Boden der Röhre erreicht hat. Inkubieren Sie die Speicheldrüsen mit Tris-Triton, das gleiche wie oben, plus 1% Beta-Mercaptoethanol für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius mit leichtem Schütteln. Mit BO3-Puffer waschen und mit BO3 plus 10 Millimolar DTT bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln 15 Minuten lang inkubieren.
Führen Sie am Ende der Inkubationszeit eine Wäsche mit einem Milliliter BO3-Puffer allein durch. Inkubieren Sie die Speicheldrüsen in einem Milliliter Puffer B für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit Rotation. Entfernen Sie alle Puffer B und fügen Sie Puffer A plus Antikörper von Interesse hinzu.
In diesem Fall verwenden wir HP one, A C 1 8 9 von Iridium Bank. 1 zu 3.000 über Nacht bei vier Grad mit Rotation. An dieser Stelle ist wichtig, dass das Schütteln keine Blasen aufwirft, die den Antikörper schädigen könnten.
Behandeln Sie die Behandlung nach 15 Minuten mit Puffer B, unter Rühren bei Raumtemperatur mit jeweils einem Millimeter. Die Drüsen werden zusammen mit dem sekundären Antibiotikapaar auf einen Boden übertragen, der für zwei Stunden unter Rotation bei vier Grad auf Puffer B bezogen wird. In diesem Schritt ist es wichtig, das Röhrchen mit Aluminiumpapierfolie abzudecken, um den sekundären Antikörper vor dem Licht zu schützen.
Führen Sie 2x15-Minuten-Unterlegscheiben bei Raumtemperatur durch, während Sie mit einem Milliliter Puffer B drehen.Mit einem DNA-Marker wie Sydox oder OH in einem Milliliter Puffer B auflösen und in einem Milliliter Puffer B für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Rotation auflösen. Führen Sie eine Wäsche mit Puffer B und einmal mit PBS durch, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauert, während Sie bei Raumtemperatur rotieren. Montieren Sie schließlich die Speicheldrüsen auf einer Rutsche und machen Sie einen Pool mit einem Abdeckungsrutsch.
Legen Sie die Speicheldrüsen in die Mitte des Pools und bedecken Sie sie mit Sidiflor. Um eine Verformung der Blase zu vermeiden, wird die viskose Flüssigkeit überall hin ausgedehnt. Dann versiegeln Sie alle Dias mit klarem Nagellack.
Unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop beobachten. Wenn die Probe nicht am selben Tag beobachtet wird, lagern Sie sie aus dem Licht bei vier Grad. Repräsentative Ergebnisse der HB1-Monofärbung in Drosophila-Speicheldrüsen sind in Abbildung eins dargestellt.
Ein positives Ergebnis ist die Beobachtung eines Brennpunkts wie in A, atherochromatischem Aggregat oder Kondensat. Ein negatives Ergebnis ist kein Signal oder ein dispergiertes Signal. Manchmal kann ein Doppelsignal wie ein Doppelpunkt in C beobachtet werden, tritt aber normalerweise in kleineren Mengen auf.
Um die Daten zu analysieren, können sie als Balkendiagramm dargestellt werden, wobei die Verteilung von HP1 mit verschiedenen mutanten Hintergründen verglichen wird. Zum Beispiel können wir in Abbildung zwei sehen, dass 98% der Kerne eine Verteilung von einem Punkt aufweisen. Und 2% von zwei Herden im Wildtyp.
In der Mutante änderte sich der Anteil und das Vorhandensein von zwei Herden erhöhte sich auf 40%Abbildung drei zeigt repräsentative Trimethylierungslysin 9H3 bei Monofärbung. Ergebnis in Drosophila Speicheldrüsen beobachten einen Brennpunkt in B, es ist ein günstiges Ergebnis am chromatischen Aggregat oder Kondensat, ein Doppel- oder Dreifachsignal in C kann selten gesehen werden, aber in kleinen Mengen. Am Ende dieses Protokolls können Sie trotz Zustandsbeschränkungen ein diachromatisches Kondensat von HP1-Protein sehen, es wird ein guter erster Ansatz sein.
