In diesem Video zeigen wir, wie die AAV-Transduktion in der Netzhaut der Maus mit der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode quantifiziert werden kann, die extrem empfindlich ist und eine absolute Quantifizierung der Ziel-DNA durchführt. Wir haben diese Methode hauptsächlich für große AVV-Konstrukte entwickelt, die es uns nicht erlauben, ein Reportergen wie CRISPR-basierte Konstrukte zu verwenden. Mit dieser Methode können wir einfach die Transduktionsrate von AAVs in der Netzhaut quantifizieren.
Diese Methode beruht auf der Sensitivität und absoluten Quantifizierung der digitalen Tröpfchen-PCR und liefert einfache Ergebnisse. In diesem Video zeigen wir, wie die AAV-Transduktion in der Netzhaut der Maus mit der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode quantifiziert werden kann, die extrem empfindlich ist und eine absolute Quantifizierung der Ziel-DNA durchführt. Wir haben diese Methode hauptsächlich für großflächige Konstrukte entwickelt, die es uns nicht erlauben, ein Reportergen wie CRISPR-basierte Konstrukte zu verwenden.
Mit dieser Methode können wir einfach die Transduktionsrate von AAVs in der Netzhaut quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Sensitivität und absoluten Quantifizierung der PCR mit zwei Tröpfchen und liefert einfache Ergebnisse. Aufgrund der Effizienz der digitalen Tröpfchen-PCR-Methodik wechseln bereits mehrere Labore von der quantitativen Real-Time-PCR zur digitalen Tröpfchen-PCR oder AAV-Titrierung.
Diese Methode kann auch eine Grundlage für die mitochondriale DNA-Quantifizierung in der Netzhaut sowie die Überprüfung der Effizienz der CRISPR-basierten Mutationskorrektur für die Gentherapie in der Netzhaut der Maus liefern. Bereiten Sie eine Transfektionsmischung mit AAV-Hilfsplasmid, AAV-Kapsidplasmid, AAV-Vektor und PI-Lösung in fünf Millilitern vor. Die fünf Milliliter vorbereitete Transfektionsmischung in Nährmedien geben.
Transfizierte Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sammeln Sie das Medium 48 bis 60 Stunden nach der Transfektion. Das Medium mit DNAs in einer Endkonzentration von 250 Einheiten pro Milliliter für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius aufbereiten und bei 4.000 g vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren.
Benetzen Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS vor. Filtern Sie das Medium mit 0,22 Mikrometer Spritzenfilter in die vorbenetzte regenerierte Cellulosemembran für 100 Kilo Dalton. Die regenerierte Cellulosemembran bei 4.000 G vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren und das Medium entsorgen.
Waschen und zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS, das 0,001% pluronic F68 enthält, dreimal bei 4000 G vier Grad Celsius für 30 Minuten. Sammeln Sie konzentrierte AAVs aus dem oberen Teil der regenerierten Cellulosemembran und verteilen Sie sie für die weitere Verwendung. Hier haben wir gezeigt, wie man eine kleinere AAV-Produktion herstellt.
Nach der Überprüfung dieses Protokolls sollten Sie in der Lage sein, AVVs zu erstellen, die ausreichen, um den Reporterausdruck in der Netzhaut zu sehen. Sie können auch dem Protokoll für die digitale PCR folgen, um die produzierten AAVs titeren zu können. Tragen Sie vor der Narkose einen Tropfen 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid mit Augentropfen auf, um die Pupillen zu erweitern.
Betäuben Sie Mäuse mit Isofluran und überprüfen Sie die Reflexe. Tragen Sie vor dem Injektionsvorgang 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason sterile ophthalmologische Lösung Augentropfen auf jedes Auge auf. Verwenden Sie den Operationshaken, um das obere Augenlid zu stabilisieren.
Ziehen Sie sich leicht zurück, um den dorsalen Teil des Auges freizulegen. Kleben Sie den Haken an das Band, um ihn in Position zu halten. Entfernen Sie die Bindehaut mit der gebogenen Irisschere, um die Sklera des Auges freizulegen.
Verwenden Sie eine frische und sterile 30G Insulinspritze, um die Sklera zu punktieren. Führen Sie die Nadel der Mikrospritze mit einem Mikromanipulator durch dieselbe Punktion. Platzieren Sie die Nadelspitze hinter der Linse in der Mitte der Augenmuschel.
Injizieren Sie einen Mikroliter AAV-Lösung langsam in den Glaskörper des Auges. Lassen Sie die Nadel für eine Minute an Ort und Stelle und ziehen Sie die Nadel langsam zurück. Tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle topische Gelbehandlung mit 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason auf die Augenmuschel auf.
Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Tropicamid auf. Und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid mit Augentropfen vor der Anästhesie, um die Pupillen zu erweitern. Tragen Sie Carbamid zwei Milligramm pro Gramm topisches Gel auf die Oberfläche der Augen auf.
Stellen Sie den Mausständer nach Bedarf ein, um das Mausauge zu zentrieren. Führen Sie eine Fundus- und Fluoreszenzbildgebung an beiden Augen durch, um die TdTomato-Expression eine Woche und zwei Wochen nach der intravitrealen Injektion zu verfolgen. Euthanasie der Tiere durch Kohlendioxid-Inhalation vor dem Eingriff.
Verschieben Sie den Augapfel mit Hilfe einer 13,5 Zentimeter großen Splitterzange nach vorne. Entfernen Sie die Linse zusammen mit dem übrig gebliebenen Glaskörper. Schneiden Sie die Verbindung des Augapfels zum Sehnerv mit einer präzise gekrümmten Pinzette ab und drücken Sie die Netzhaut vorsichtig mit der gleichen gekrümmten Pinzette zusammen.
Isolieren Sie genomische DNA mit einem kommerzialisierten Proteinase-K-Digest-Film-basierten genomischen DNA-Kit für Gewebe. Verdauen Sie die Netzhaut bei 55 Grad Celsius 200 G für 30 Minuten mit Proteinase K.Lyse Netzhaut vollständig und folgen Sie dem Sprotocol des Herstellers. In diesen Protokollen haben wir eine intravitreale Injektion von Fundusblütenbildgebung sowie eine Netzhaut- und genomische DNA-Isolierung gezeigt.
Dies sind sehr kritische Verfahren für die Netzhaut, und wenn Sie dieses Protokoll befolgen, sollten Sie in der Lage sein, die produzierten AAVs zu injizieren und ihr Expressionsprofil zu verfolgen. Und diese Transduktionseffizienz durch die Quantifizierung von AAV-Genomen in retinaler genomischer DNA. Hier können Sie die grundlegende Anwendung der digitalen Tröpfchen-PCR sehen, bei der Sie eine absolute Quantifizierung des AAV-Genoms vornehmen können, das in den Netzhautzellen transduziert.
Verdünnung genomischer DNAs aus injizierter Netzhaut in 0,05% pluronischer F 68-Lösung, um eine Endkonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliter für jede Probe zu erreichen. Führen Sie Tröpfchengenerierung in einer 20 Mikroliter PCR-Reaktionsmischung durch, einschließlich eines Nanogramms genomischer DNA 125 Nanomolar-Primer und 2X immergrüner Supermischung. Laden Sie die Probenmischung zur Tröpfchenerzeugung in den mittleren Teil der Kartusche.
Anschließend werden 70 Mikroliter Tröpfchenerzeugungsöl in die untere Reihe der Kartusche gegeben. Setzen Sie die Dichtung auf die Patrone. Stellen Sie sicher, dass kein Spalt zwischen der Dichtung und der Kartusche besteht.
Legen Sie es dann in den Tröpfchengenerator. Nehmen Sie vorsichtig etwa 40 Mikroliter Tröpfchen, die in der oberen Glocke erzeugt werden. Geben Sie die Tröpfchenlösung in die halbseitige 96-Well-PCR-Reaktionsplatte.
Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einem PCR-Plattenversiegeler unter Verwendung von Aluminium-Dichtfolie. Legen Sie die PCR-Platte in den 96-Well heißversiegelten Thermocycler. Verwenden Sie das im Artikel angegebene ddPCR-Protokoll.
Legen Sie die PCR-Platte in den Tröpfchenleser, um die Daten zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, grundlegende digitale PCR-Techniken durchzuführen. Sie können auch beanspruchte Zellen mit geringen Materialmengen verwenden, was ideal für die digitale PCR-Technik ist.
Sie sollten jedoch die Ziel-DNA-Menge sorgfältig anpassen, um die Grenze der digitalen Tröpfchen-PCR nicht zu überschreiten. Hier ist das Flussdiagramm für das experimentelle Verfahren. Wir führten eine AAV-Produktion im kleinen Maßstab durch, gefolgt von der AAV-Titerierung.
Dann führten wir eine intravitreale Injektion durch. Anschließend quantifizierten wir die Fluoreszenzintensität durch Fundusfluoreszenzbildgebung. Dann isolierte sich die Netzhaut der Maus und extrahierte genomische DNA aus der Netzhaut für ddPCR.
Die Titerierung von AAV ist auch entscheidend, um die AAV-Transduktion korrekt quantifizieren zu können. ddPCR hängt von der Erzeugung von Tröpfchen ab, die das Ziel-AAV-Genom verdünnt haben. Repräsentative ddPCR-Ergebnisse zeigen positive und negative Tröpfchen für das AVV-Genom.
Positiv über dem Schwellenwert und negativ ist darunter. Nach der Multiplikation mit den Verdünnungsfaktoren wurde festgestellt, dass der Titer der AAVs 10 zu den 12 in Genomkopien pro Milliliter betrug. Um die AAV-Tranduktionseffizienz korrekt zu quantifizieren, wurden mehrere Netzhäute injiziert.
Injizierte Tiere wurden abgebildet und die mittlere Fluoreszenzintensität wurde berechnet. Nach zwei Wochen wurde die Netzhaut isoliert. Und ddPCR wurde mit WPRE und 18 S Primern durchgeführt.
Die Fluoreszenzintensität der injizierten AAV-Netzhaut korrelierte mit AAV-Genomberechnungen, was die Leistungsfähigkeit der Methodik zeigt. Hier haben wir verschiedene Techniken gezeigt, einschließlich der intravitrealen Injektion der AAV-Vorbereitung im kleinen Maßstab.
