Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um massive pontine Blutungen bei einer Ratte festzustellen. Dieses Modell ist einfach zu etablieren, wiederholbar und sehr erfolgreich. Die destillierte Injektion der autologen Rattenmethode könnte verwendet werden, um Blutungen in jeder der Gehirnregionen zu machen.
Menschen, die diese Techniken ausprobieren möchten, sollten lernen, wie man einen stereotaxischen Rahmen verwendet, und mit der pontinen Anatomie vertraut sein. Beginnen Sie, indem Sie einen chirurgischen Vorhang über die Maus legen. Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell entlang der markierten Mittellinie.
Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um potenzielles Blut zu entfernen. Legen Sie dann ein Stück Pinzette auf jede Seite der Kopfhautklappe, um den Schädel freizulegen. Tauchen Sie einen Wattestäbchen in 0,9% Kochsalzlösung und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe vom Schädelknochen.
Verwenden Sie einen Markerstift, um den zentralen Punkt der Bregma als Ursprungspunkt zu markieren. Führen Sie eine Kraniotomie mit einem Mikrobohrer durch und gehen Sie vorsichtig vor. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Mikrobohrer aus dem stereotaktischen Rahmen.
Stecken Sie eine 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze in den stereotaxischen Halter. Schalten Sie den Einspritzpumpenschalter ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche schnelle Inhalation.
Dann heparinische Lösung auf 100 Mikroliter absaugen und vollständig abtropfen lassen. Tragen Sie Chlorhexidin und 75% Alkohol chirurgisches Peeling auf die ganze Geschichte von der Wurzel bis zur Spitze mindestens dreimal auf, um die Haut zu desinfizieren, die Geilheit zu erweichen und die Schwanzvene zu erweitern, um die Erfolgsrate der Injektion zu erhöhen. Befestigen Sie eine Kopfhautakupunktur an einer Ein-Milliliter-Spritze, führen Sie dann die Kopfhautakupunktur in eine seitliche Schwanzvene drei Zentimeter von der Schwanzspitze entfernt ein und nehmen Sie 150 Mikroliter Blut.
Entfernen Sie die Kopfhautakupunktur aus der Ein-Milliliter-Spritze und übertragen Sie das Blut in einen Schlauch. Schnelle Arbeit, um blutgerinnung zu verhindern. Op-Handschuhe wechseln.
Wählen Sie den Auszahlungsmodus aus. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 Mikroliter und die Geschwindigkeit auf 200 Mikroliter pro Minute ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen" und saugen Sie 100 Mikroliter Blut in die Hamilton-Spritze.
Wechseln Sie in den Infuse-Modus und stellen Sie die Geschwindigkeit auf einen Mikroliter pro Minute ein. Schieben Sie die Spritze vor, bis die Spitze 9,2 Millimeter unter der Oberfläche des Gehirns liegt, und injizieren Sie die ersten 10 Mikroliter Blut. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen.
Stoppen Sie die Injektion und lassen Sie die Spritze 20 Minuten lang in Position, um zu verhindern, dass Blut in den Subarachnoidalraum fließt. Ziehen Sie die Spritze zurück, bis die Spitze neun Millimeter unter der Oberfläche des Gehirns ankommt, und starten Sie dann die Injektion mit der gleichen Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute, bis das Restblut vollständig injiziert wurde. Lassen Sie die Spritze 10 Minuten in Position, um einen Blutrückfluss zu vermeiden.
Entfernen Sie die Spritze langsam aus dem Gehirn. Verwenden Sie dann Knochenzement, um das Kraniotomieloch zu bedecken. Wenn der Zement trocknet, nähen Sie die Wunde mit einem Vier-Null-Polyamid-Nahtfilament.
Nach dem Nähen binden drei oder vier Stiche 2 Eins-Eins-Standard-CHIRURGISCHE KNOTEN. Beobachten Sie die Ratte alle 15 Minuten, bis sie sich vollständig von der Anästhesie erholt hat, und bringen Sie sie dann mit einem Heizkissen darunter in den ursprünglichen Käfig zurück. Bieten Sie der Ratte freien Zugang zu Nahrung und Wasser.
Insgesamt wurden 25 Tiere zur Kontrolle von 30 Mikroliter-, 60-Mikroliter- und 100-Mikroliter-Blutinjektionen verwendet. Verhaltenstests wurden an den Tagen eins, drei, sieben und 14 nach der Operation durchgeführt. Pontinische Blutungen verursachten neurologische Defizite wie verminderten Hornhautreflex und Kreisen.
Die Injektion von 100 Mikrolitern Blut induzierte auch die Myotonie. MrT-Scanning wurde 24 Stunden nach der Operation durchgeführt. In den Blutinjektionsgruppen wurde Hämorrhage als Hypointense-Rand mit einem ISO- bis leicht hyperintensen Kern im Basiler-Teil der Teiche nachgewiesen.
Das Blutungsvolumen nahm mit dem Injektionsvolumen zu. Die Ratten wurden 24 Stunden und 14 Tage nach der Operation geopfert. Und zwei Millimeter dicke Abschnitte wurden gemacht.
Blutungen wurden um die Injektionsstelle herum festgestellt und verteilen sich in der Basis der Teiche. Es gab ein leichtes Ödem um die Blutung in der 100-Mikroliter-Blutinjektionsgruppe. Einige der Ratten wurden drei Tage nach der Operation geopfert und Paraffinabschnitte wurden für die HE-Färbung hergestellt.
Die Ergebnisse zeigten, dass in den Blutinjektionsgruppen Entzündungszellen, die in der Parablutungszone angereichert waren, das Hämoglobin mit intakten roten Blutkörperchen enthalten blieb. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass Sie sich die Injektionsposition merken. Diese Methode kann verwendet werden, um eine Blutung in jeder spezifischen Hirnregion zu induzieren.
