Dieses Protokoll induziert Hyperglykämie bei Zebrafischen in einem Anstiegs- und Fallmuster, das die Hyperglykämie nachahmt, die bei Typ-Zwei-Diabetes beobachtet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine nichtinvasive Technik handelt, die es ermöglicht, sicherzustellen, dass Hyperglykämie die Ursache für alle Veränderungen ist, die bei den hyperglykämischen Fischen beobachtet werden. Dieses Protokoll könnte möglicherweise verwendet werden, um therapeutische Wege oder Arzneimittel zu erforschen, die auf Komplikationen der Hyperglykämie abzielen.
Dieses Protokoll hat viele Schritte, aber wenn die Schritte richtig und mit Sorgfalt befolgt werden, sollte es schnell zur zweiten Natur werden. Denken Sie jedoch daran, die Tiere während des gesamten Protokolls immer sanft und menschlich zu behandeln. Beginnen Sie mit dem Aufstellen von sechs Panzern, zwei für jede experimentelle Gruppe.
Verwenden Sie Zwei-Liter-Tanks, wenn die Gesamtzahl der Fische weniger als 20 beträgt, und Vier-Liter-Becken, wenn die Gesamtzahl der Fische mehr als 20 beträgt. Beschriften Sie einen der beiden Tanks, den Gehäusetank und den anderen Lösungstank. Halten Sie die Tanks in einem Wasserbad bei 28 bis 29 Grad Celsius, um die Wassertemperatur zu halten.
Am ersten Tag legen Sie die Fische für 24 Stunden in ihre jeweiligen Behandlungslösungen. Am zweiten Tag die Fische für 24 Stunden von ihren Behandlungslösungen ins Wasser geben. Am dritten Tag den Fisch aus dem Wasser in Behandlungslösungen überführen.
Setzen Sie diese abwechselnde Belichtung für den Rest des Experiments fort. Tägliche Übertragung von wasserbehandelten Kontrollfischen von Wasser zu Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Fische während der gesamten Dauer des Experiments jeden Tag innerhalb desselben zweistündigen Fensters gefüttert und übertragen werden.
Übertragen Sie Fische in jeder Behandlungsgruppe mit einem Standardfischnetz aus dem Haltungsbecken in das entsprechende Lösungsbecken. Stellen Sie den Tank mit dem Fisch wieder in das Wasserbad und ersetzen Sie den Luftstein und den Tankdeckel. Dieser Tank ist jetzt der Gehäusetank und der Tank, der zuvor den Fisch hielt, ist jetzt der Lösungstank.
Entsorgen Sie die alte Lösung und reinigen Sie den Tank zusammen mit den Tankdeckeln, Luftleitungen, Luftsteinen und Netzen, um die Ansammlung von Glukose und Mannit zu verhindern. Verwenden Sie Wasser und einen speziellen Schwamm für jede Behandlungsbedingung, um die Tanks richtig zu reinigen. Trocknen Sie die neu gereinigten Lösungstanks mit einem Papiertuch und bereiten Sie die Lösungen mit diesem Tank für den nächsten Tag vor.
Stellen Sie sicher, dass die anderen Gegenstände getrocknet und durch geeignete Behandlungsgruppen getrennt sind. Um die Zuckerlösungen vorzubereiten, füllen Sie jeden Lösungstank mit zwei oder vier Litern Systemwasser. Messen Sie die richtige Menge an Glukose und Mannit mit einer Top-Loading-Waage und separaten Wiegebooten für jede Chemikalie.
Geben Sie die gewogene Glukose oder das Mannitol-Aliquot in den entsprechenden Sauberlösungstank. Rühren Sie die Lösungen mit separaten Glasrührstäben um, bis der Zucker vollständig aufgelöst ist. Dann bringen Sie die Lösungstanks in das Wasserbad zurück und bedecken sie mit den entsprechenden Deckeln.
Um die Wasserlösung vorzubereiten, füllen Sie Versuchstanks mit Systemwasser Geben Sie diese Lösungstanks in das Wasserbad zurück und bedecken Sie sie mit den entsprechenden Deckeln. Die Blutzuckerwerte waren sowohl nach vierwöchigen als auch nach achtwöchigen Glukosebehandlungen signifikant erhöht. Mit Hyperglykämie definiert als das Dreifache der Kontrollmittelwerte sowohl aus wasserbehandelten als auch aus Mannitol behandelten Gruppen.
Netzhautgewebe, das nach vier Wochen Hyperglykämie gesammelt wurde, hatte einen Anstieg des Gliafibrillär-sauren Proteins oder gfAP-Spiegels. Die GFAP-Expression wird in Mueller-Gliazellen in der Netzhaut beobachtet, die bei diabetischer Retinopathie verändert sind. Dieser Anstieg der GFAP war mit einem Anstieg der KappaB-Spiegel des Kernfaktors verbunden.
Dies deutet darauf hin, dass die induzierte Hyperglykämie eine Entzündungsreaktion und reaktive Gliose auslöst. ERG-Aufnahmen nach vierwöchiger Behandlung identifizierten ein vermindertes Ansprechen der mit Glukose behandelten Netzhaut im Vergleich zu mit Mannit behandelten Kontrollen. Die Amplituden sowohl der Photorezeptor- als auch der bipolaren Zellkomponenten waren bei hyperglykämischen Fischen verringert.
Dieses Verfahren kann durch andere Tests der Hyperglykämie ergänzt werden. Zum Beispiel kann ein Gedächtnistest verwendet werden, um kognitive Defizite zu untersuchen oder visuelle Reaktionen wie die optomotorische Reaktion aufzuzeichnen, um sehbasierte Komplikationen zu beurteilen. Sobald diese Technik etabliert war, konnte unser Labor sie verwenden, um hyperglykämie-induzierte Komplikationen im Zebrafischmodell zu untersuchen.
Wir beobachteten diese Komplikationen relativ schnell, nach vier Wochen Behandlung.
