Dieses Protokoll ist aufgrund der Einfachheit der TGT-Sensorplattform, die zur Untersuchung des EGFR-Integrin-Übersprechens und seines Einflusses auf die mechanischen Kräfte der Zelle verwendet wird, von Bedeutung. Rao skizzierte, um die EGF-abhängige Regulation der Zellmechanik zu untersuchen. Das Protokoll ist für verschiedene Liganden, Zelltypen und Stimulationsparadigmen anpassbar und kann mit TGTs unterschiedlicher Spannungsschwellen gekoppelt werden.
Die Oberflächensynthese mag auf den ersten Blick einschüchternd wirken. Der Schlüssel liegt darin, vorbereitet und organisiert zu sein, um die komplizierten Schritte präzise auszuführen, indem eine Checkliste für die Reagenzienvorbereitung und -berechnungen verwendet wird. Legen Sie am ersten Tag bis zu acht 25-Millimeter-Glasabdeckungen in ein Polytetrafluorethylen-Rack.
Stellen Sie das Gestell in ein 50-Milliliter-Borosilikatbecherglas mit 40 Millilitern 200-prozentigem Ethanol. Beschallen Sie bei einer Betriebsfrequenz von 35 Kilohertz für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. Füllen Sie ein 50-Milliliter-Becherglas mit 40 Millilitern Piranha-Lösung, frisch zubereitet, indem Sie Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 in einem Pyrex-Becherglas mischen und mit einer Glaspipette umrühren.
Den Abdeckschlitten in das Becherglas geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug inkubieren, um die Deckrutschfläche zu ätzen. Nach dem Ätzen das Deckglasgestell mit einer Pinzette auf ein Becherglas mit Reinstwasser geben. Überprüfen Sie die Decksscheine visuell, um sicherzustellen, dass die Oberflächen sauber und ohne Muster oder Staubpartikel auf der Glasoberfläche aussehen.
Legen Sie das Deckglasgestell in ein Becherglas mit 200-festem Ethanol und waschen Sie es zweimal für 15 Sekunden, um die Oberflächen mit organischem Lösungsmittel auszugleichen. Geben Sie das Deckglasgestell für eine Stunde bei Raumtemperatur in eine 200-prozentige Ethanollösung mit 3% APTES, um die Deckgläser zu silanisieren. Tauchen Sie das Gestell in ein sauberes Becherglas mit 200-prozentiger Ethanollösung.
Trocknen Sie die Deckgläser mit Stickstoffgas mit niedrigem Austrittsdruck. Legen Sie den Bezug in eine 10 Zentimeter große Styroporschale, in der ein Stück Parrafin-Folie flach hineingelegt wird. Fügen Sie 100 Mikroliter von zwei Milligramm pro Milliliter NHS-Biotinlösung in DMSO zu vier Deckgläsern hinzu, die auf Paraffinfolie platziert sind.
Legen Sie ein Sandwich mit den anderen vier Deckgläsern darauf, mit zwei zueinander gerichteten Deckgläsern mit der Funktionalisierungslösung dazwischen. Nehmen Sie am zweiten Tag die Schale von vier Grad Celsius und trennen Sie die Sandwich-Deckzettel. Vermeiden Sie Kratzer oder Beschädigungen der funktionalisierten Oberfläche beim Trennen des Sandwiches.
Richten Sie dann die Abdeckscheine im Rack aus, wobei die beschichtete Oberfläche einander zugewandt ist. Mit Stickstoffgas trocknen. Legen Sie die Deckblätter in eine neue Schüssel mit einer Parrafin-Folie darin.
Fügen Sie jedem Deckblatt 800 Mikroliter 0,1% Rinderserumalbumin in 1X PBS hinzu. Inkubieren Sie die Deckscheine bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um die Oberfläche zu passivieren und die unspezifische Bindung nachfolgender Funktionalisierungsreagenzien zu blockieren. Um die Deckscheine zu funktionalisieren, fügen Sie 800 Mikroliter eines Mikrogramms pro Milliliter Streptavidin in 1X PBS bei Raumtemperatur für 45 bis 60 Minuten hinzu.
Montieren Sie die TGT-Sonden in einem PCR-Rohr mit einem Thermocycler. Nach der Inkubation waschen Sie die Deckblätter dreimal mit 1X PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter der vormontierten TGT-Sonden zu vier Deckschüben hinzu und machen Sie Sandwiches mit den restlichen vier Deckschüben mit der funktionalisierten Seite zu den Sonden.
Abdeckung mit Aluminiumfolie. Nach der Inkubation die Sandwiches trennen und die Deckgläser dreimal mit 1X PBS waschen. Montieren Sie die Abdeckscheine vorsichtig in vorgereinigte Bildgebungskammern.
Um die Wirkung der epidermalen Wachstumsfaktorstimulation auf die Cos-7-Mechanik, Adhäsion und Zellausbreitung zu untersuchen, trypsinisieren Sie Cos-7-Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA für zwei Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie es mit HBSS waschen und fünf Minuten lang bei 800 G zentrifugieren. Plattenzellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen auf den zusammengesetzten TGT-Oberflächen in DMEM ergänzt um 50 Nanogramm pro Milliliter EGF oder DMEM ohne EGF.
Nach der Inkubation die Zellen dreimal mit 1X PBS waschen. Mit zwei Millilitern 4%Paraformaldehyd für 12 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie die Deckblätter fünfmal mit 1X PBS im Fünf-Minuten-Takt bei Raumtemperatur.
Optional können Sie die Deckgläser mit 50-Millimol-Ammoniumchlorid in 1X PBS für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie Puffer A hinzu und legen Sie die Bildgebungskammern mit Deckgläsern in einen Feuchtigkeitsbehälter. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu blockieren und zu durchpermeabilisieren.
Verdünnen Sie den primären Anti-Paxillin-Antikörper bei 1:250 Verdünnungen im Blockpuffer. Mit 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung pro Deckglas zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Markieren Sie die Zellen gleichzeitig mit einer Mischung aus dikonjugiertem Ziegen- / Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper bei 1:800-Verdünnung und dikonjugiertem Phalloidin bei 1:400-Verdünnungen in 200 Mikrolitern Sperrpuffer pro Deckglas.
Waschen Sie die Oberflächen fünfmal mit 1X PBS im Fünf-Minuten-Takt. Geben Sie zunächst Öl in das Objektiv, reinigen Sie den Deckglasboden der Probenkammer und legen Sie die Probe auf den Tisch. Konzentriere dich auf eine Zelle und interagiere den perfekten Fokus.
Richten Sie den RICM aus, indem Sie die Blende der Epiilluminationsblende schließen und zentrieren. Fokussieren Sie den 488-Nanometer-Laser auf einen kleinen Punkt an der Decke des Raumes und erhöhen Sie den Einfallswinkel bis über den kritischen Winkel hinaus, während Sie die Fluoreszenz an der Kamera in einem Live-Modus überwachen. Beobachten Sie eine starke Verringerung der Hintergrundfluoreszenz und eine einzelne In-Fokus-Ebene, wenn der kritische Winkel überschritten wird.
Identifizieren Sie Zellen für die Bildgebung im Live-Modus der Kamera mit RICM. Erfassen Sie die RICM- und TIRF-Bilder von Aktin bei 488-Nanometer-Anregung, Integrinspannung bei 561-Nanometer-Anregung und Paxillin bei 647-Nanometer-Anregung. Erhalten Sie Bilder nacheinander mit einer Belichtungszeit von 200 Millisekunden.
Deckzettel wechseln, fokussieren und wiederholen. Cos-7-Zellen wurden auf dieser TGT-Oberfläche mit oder ohne EGF-Stimulation plattiert, um den Einfluss der EGFR-Aktivierung mit Ligandenstimulation auf die Integrinmechanik zu untersuchen. Wenn ein Integrin den Liganden bindet und eine Kraft ausübt, die größer ist als die Spannungsschwellensumme der Sonde, trennt sich der DNA-Duplex, was zu Fluoreszenz führt.
Jede TGT-Sonde, bei der eine mechanische Kraft nicht gerissen ist, bleibt nicht fluoreszierend. Die Zellen wurden 60 Minuten lang mit oder ohne EGF auf den TGT-Oberflächen inkubiert, fixiert und immungefärbt, um die fokale Adhäsionsverteilung und die Organisation des Zytoskeletts anzuzeigen. Im RICM-Bild wurde die Cos-7-Zellstreuung auf der 56-Piconewton-TGT-Oberfläche mit EGF-Stimulation im Vergleich zu ohne Stimulation signifikant verbessert.
Die Stimulation mit EGF führte zu einer zirkuläreren Morphologie, die die Ausbreitung und das Wachstum von Cos-7-Zellen darstellt. Die Fluoreszenz von offenen Sonden ist auch bei der EGF-Stimulation höher, wie im Spannungsfluoreszenzbild beobachtet. Die integrierte Intensität der offenen Sonden proportional zur Anzahl der offenen Sonden war mit der EGF-Stimulation viel höher als ohne Stimulation.
Denken Sie immer an die Ausrichtung der Abdeckscheine und halten Sie die funktionalisierte Oberfläche nach oben. Seien Sie beim Trennen des Sandwiches vorsichtig, damit die Oberfläche nicht zerkratzt oder beschädigt wird. Nach der Oberflächensynthese kann man nach zytoplasmatischen Proteinen suchen, die die Zelladhäsion oder die mechanische Transduktion regulieren.
Dies ermöglicht die Identifizierung nachgeschalteter Signalmoleküle, die an der Orchestrierung der Zellmechanik an der Plasmamembran beteiligt sind.
