Dieses Protokoll ermöglicht es, interzelluläre Kalziumsignalmuster aufzudecken, die jede Zelltypreaktion sowohl in der Gesundheit als auch in der Krankheit charakterisieren. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und detaillierte biophysikalische Charakterisierung des komplexen zellulären Verhaltens. Wir planen, diese IgG-induzierte Kalziumsignalisierung als Fingerabdruck für die personalisierte Medizin neuroinflammatorischer Erkrankungen zu nutzen.
Im wirklichen Leben ist es nicht einfach, alle Prozesse und Ereignisse zu sehen und zu verfolgen, insbesondere diejenigen, die unter dem Mikroskop ablaufen. Daher sind die visuellen Daten wichtig. Nachdem Sie ein bis drei Tage alte Welpen enthauptet haben, legen Sie den Schädel frei, indem Sie die Haut mit einer kleinen Winkelschere aufschneiden.
Öffnen Sie dann den Schädel, indem Sie das Foramen magnum in Richtung der Augenhöhlen schneiden und einen senkrechten Mittellinienschnitt machen. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in eine Petrischale mit PBS. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette, um die Verbindungen zwischen beiden Hemisphären zu reißen, und trennen Sie die Hemisphären mit gebogenen Pinzetten, indem Sie eine Halbkugel vorsichtig von der Mitte zur Seite drücken.
Verwenden Sie gerade und gebogene Pinzetten, um die Hirnhäute zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig zerreißen. Entfernen Sie dann den Hippocampus, indem Sie ihn mit einer gekrümmten Pinzette einklemmen und verwerfen oder für eine andere Zellkulturzubereitung verwenden. Als nächstes übertragen Sie den Kortex in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter kaltes PBS enthält, und homogenisieren das Gewebe, indem Sie 10 bis 15 Mal mit einer Ein-Milliliter-Spitze auf und ab pipettieren.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 g für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter kaltem PBS, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spitze pipettieren. Zentrifugieren Sie noch einmal und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter komplettem DMEM, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika.
Nach dem Transfer des Homogenats in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen wird das Homogenat durch 21- und 23-Gauge-Nadeln geleitet, um eine Suspension aus einzelnen Zellen herzustellen. Gießen Sie die aus einem Kortex hergestellte Zellsuspension in eine 60-Millimeter-Petrischale mit drei Milliliter vollständigem DMEM und schütteln Sie die Petrischale leicht, so dass die Suspension gleichmäßig verteilt ist. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 37 Grad Celsius.
Um das Wachstum von Astrozyten zu fördern, entfernen Sie die alten Medien und waschen Sie die Zelle mit vorgewärmtem PBS, um die lose anhaftenden Gliazellen und Spuren von FBS zu entfernen, sobald sie 70 bis 80% Konfluenz erreicht haben. Dann trypsinisieren Sie die darunter liegende Schicht von Astrozyten, indem Sie einen Milliliter vorgewärmter Trypsinlösung hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für zwei bis fünf Minuten inkubieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen zu lösen beginnen, und fügen Sie vier Milliliter vollständiges DMEM hinzu.
Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Als nächstes bereiten Sie die Kulturschale vor und fügen Sie ein Kulturmedium hinzu. Replaten Sie die Zellen bei einer Dichte von 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter in fünf Milliliter frischem komplettem DMEM und waschen Sie die Zellen vor jedem Medienwechsel mit vollständigem DMEM.
Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 80% die Trypsinisierung wiederholen und fünf mal 10 bis zum dritten Astrozyten auf einem sieben Millimeter dicken, mit Poly-L-Lysin beschichteten kreisförmigen Glasdeckstreifen säen. Lassen Sie sie 10 Minuten lang anbringen und fügen Sie das vollständige DMEM hinzu. Verwenden Sie sie nach 48 Stunden in Experimenten.
Nach der Vorbereitung der Mikrogliakulturen, um Mikroglia zu fördern, lassen Sie die Gliazellen konfluieren, und die Mikroglia erscheinen nach 10 bis 15 Tagen auf der Astrozytenschicht. Schütteln Sie die Petrischale auf einem Orbitalschüttler zwei Stunden lang bei 220 U/min. Waschen Sie nun die abgelösten und lose befestigten Zellen leicht, indem Sie den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze absaugen.
Verteilen Sie den Überstand mehrmals vorsichtig auf die Zellschicht und stellen Sie sicher, dass die gesamte Zellschichtoberfläche während dieses Waschschritts bedeckt ist. Sammeln Sie das Medium mit den abgelösten Zellen und übertragen Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt.
Säen Sie fünf mal 10 bis zum dritten Mikroglia auf einem sieben Millimeter dicken, mit Poly-L-Lysin beschichteten kreisförmigen Glasdecker. Lassen Sie sie für 10 Minuten anbringen und fügen Sie vollständiges DMEM hinzu. Verwenden Sie sie nach 48 Stunden in Experimenten.
Um das komplette DMEM auszuwaschen, geben Sie einen Bezugsbeleg in eine Schale mit extrazellulärer Lösung. Die Farbstoffbeladungslösung wird durch Verdünnen eines Millimolaren Fluo-4 AM mit extrazellulärer Lösung hergestellt, um die Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Legen Sie den Deckkörper mit den Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln in die Farbstoffladelösung und waschen Sie die Zellen 20 Minuten in extrazellulärer Lösung.
Legen Sie den Abdeckbeleg mit einem Milliliter Arbeitslösung in die Aufnahmekammer. Wählen Sie das Sichtfeld mit einer konsistenten Anzahl von Zellen während des gesamten Experiments. Beginnen Sie die Bildgebung und bestimmen Sie den Ausgangswert, indem Sie den basalen Fluoreszenzspiegel für drei bis fünf Minuten erfassen.
Stoppen Sie dann den Fluss der Arbeitslösung und wechseln Sie für die gewünschte Zeit zur Testlösung. Zwischen jeder Testlösung werden die Zellen drei bis fünf Minuten lang mit einem konstanten Fluss der Arbeitslösung gewaschen. Halten Sie das Lösungsvolumen in der Aufnahmekammer bei einem Milliliter, indem Sie einen konstanten Sog von der Oberseite der Lösung veranlassen.
Wählen Sie den Frame mit der höchsten Signalintensität und umgeben Sie eine Zelle mit der Polygonal-Werkzeuganwendung. Nachdem Sie alle Zellen im erfassten Feld eingeschlossen haben, wählen Sie mit dem Kreiswerkzeug fünf interessante Bereiche im Hintergrund aus. Messen Sie dann die mittlere Signalintensität einer einzelnen Zelle und den Hintergrund für jeden Zeitrahmen.
Wählen Sie alle gewünschten Regionen aus und verwenden Sie den Befehl Multi-Measure im ROI-Manager in ImageJ oder einen gleichwertigen Befehl in kommerzieller Software. Nach dem Import der Daten in die MATLAB-Software ermitteln Sie durchschnittlich fünf Hintergrund-ROIs und subtrahieren den gemittelten Hintergrund jedes Frames von der mittleren ROI-Intensität der gleichzeitig erfassten Frames. Analysieren Sie später die Kalziumaktivität, indem Sie die Amplitude des Kalziumpeaks, die integrierte Änderung des Kalziumtransienten, die Zeit bis zum Peak, die Anstiegszeit, die halbe Breite und die Frequenz bestimmen.
GFAP wird verwendet, um Astrozyten sichtbar zu machen, und Iba1, um Mikroglia sichtbar zu machen. hSOD1G93A-Astrozyten reagieren auf ALS-Immunglobulin G mit einer größeren Amplitude des Kalziumtransienten, einer insgesamt stärkeren integrierten Veränderung und einer kürzeren Zeit bis zum Höhepunkt als nicht-transgene Astrozyten. Die Reaktion auf ALS-Immunglobulin G unterscheidet sich von der Reaktion auf ATP.
hSOD1G93A-Astrozyten wiesen einen höheren Gehalt an Kalziumionen in den Speichern auf, was auf eine Überlastung dieses Ions hindeutet. Mikroglia wurden kultiviert, und die mittlere Fluoreszenzintensität wurde im Laufe der Zeit extrahiert. Die Kalziumspuren von drei Zellen zeigten, dass nur eine Zelle auf ALS-Immunglobulin G reagierte, während alle Zellen auf ATP reagierten.
Die Pseudofarbbilder stellten die Fluoreszenzintensität und Basislinie als Reaktion auf ALS, IgG und ATP dar. Die Zellen müssen ausreichend belastet und die Parameter des Bildgebungssystems entsprechend angepasst werden, damit das Signal während des Experiments nicht getrennt wird. Zusammen mit der Kalziumemittierung kann eine Patch-Klemmung durchgeführt werden.
So kann ein vollständigeres Bild der Korrelation zwischen verschiedenen Membranionenströmen und Calcium-emittierenden Strömen gewonnen werden. Das Verständnis der intrazellulären Kalziumhomöostase ist von essentieller Bedeutung für die Erforschung verschiedener Reaktionen auf natürliche sowie auf stressige und äußere Reize.
