Dieses Protokoll zielt darauf ab, qualitativ hochwertige zelltypspezifische RNAs aus einer kleinen Anzahl von Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu erhalten. Es verwendet ein kürzlich verfügbares Mausmodell, das es Forschern ermöglicht, eine ribosomgebundene RNA mittels GLP-Pulldown zu isolieren. Die Methode eignet sich auch zur Isolierung von Ribosomen-gebundenen RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen.
Fügen Sie zunächst zwei Milliliter eiskalter Homogenisierungsarbeitspuffer zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel. Das Homogenat in ein Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr überführen und bei 12.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Dann wird der Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr überführt, ohne das Pellet zu stören, wobei 100 Mikroliter als Input reserviert werden. Inkubieren Sie den Überstand mit dem Anti-GFP-Antikörper bei vier Grad Celsius auf einem End-over-End-Rotator über Nacht. Das Homogenat-Antikörper-Gemisch wird in ein neues Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr mit gewaschenen Protein-G-Perlen überführt und zwei Stunden lang vier Grad Celsius auf Rotator bei 24 U/min inkubiert.
Trennen Sie die magnetischen Perlen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als die negative Fraktion, die die RNAs in EGFP-negativen Zellen und die RNAs in EGFP-positiven Zellen enthält, die nicht an Ribosomen gebunden sind. Fügen Sie einen Milliliter Salzwäschepuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Rohr kurz an, um die Perlen zu waschen.
Legen Sie dann die Röhre in ein Magnetgestell. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschschritte noch zwei weitere Male, um den Ribosomen-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie die Beads mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit in einem ThermoMixer für 30 Minuten, um RNAs aus den Beads freizusetzen.
Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell und überführen Sie den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 g für zwei Minuten. Dann pipetten Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr.
Um die RNA-Reinigungskolonne vorzukonditionieren, pipetten Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer auf die Reinigungskolonne und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 g für eine Minute. Pipettieren Sie ein gleiches Volumen von 70% Ethanol in den Zellextrakt und mischen Sie gut durch Pipettieren.
Pipettieren Sie bis zu 200 Mikroliter der Mischung in die vorkonditionierte RNA-Reinigungskolonne. Um den Verlust von Proben zu reduzieren, füllen Sie die Säule nicht mehr als 80% ihrer Kapazität. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals, bis alle RNAs in derselben Spalte jeder Fraktion gesammelt sind.
Zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten, um RNA an die Membran in der Säule zu binden. Dann setzen Sie die Zentrifugation für 30 Sekunden fort. Entsorgen Sie den Durchfluss und pipettieren Sie 100 Mikroliter Waschpuffer in die Säule.
Eine Minute zentrifugieren und dann den Durchfluss verwerfen. Pipettieren Sie 75 Mikroliter DNA-Lösung direkt in die Membran der Reinigungskolonne. Bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.
Dann pipetten Sie 40 Mikroliter Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie weitere 30 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss. 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne pipettieren und bei 8.000 g für eine Minute zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Durchfluss. Kaufen Sie PET 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne und zentrifugieren Sie bei 16.000 g für zwei Minuten. Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie die gleiche Kolonne bei 16.000 g für eine Minute, um alle Spuren des Waschpuffers zu entfernen.
Die Säule wird in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Pipettieren Sie 12 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze die Membran nicht berührt. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und eine Minute bei 1000 g zentrifugieren.
Dann bei 16, 000 G für eine Minute, um die RNA zu eluieren. Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA zu beurteilen. Lagern Sie die RNAs in einem 80-Grad-Gefrierschrank oder senden Sie sie zur weiteren Analyse aus.
Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele tragen, Gli1-CreERT2 und NuTRAP, wird uns einmal täglich Tamoxifen injiziert, jeden zweiten Tag für drei Injektionen. Immunfluoreszenzanalysen von gesammelten Geweben zeigen, dass das EGFP in interstitiellen Zellen in den Hoden exprimiert wurde. EGFP wurde auch in Nebennierenkapselzellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-Mäusen gefunden.
In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-Mäusen Die EGFP-positive Zellpopulation befindet sich im äußeren Kortex der Nebenniere unter der Kapsel, was die Expression von EGFP-präexprimierenden Zellen bestätigt. Nach der Extraktion der zelltypspezifischen RNAs wurde die extrahierte RNA zur Microarray-Analyse geschickt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 3000 Gene in der positiven Fraktion angereichert waren, verglichen mit Genen in der negativen Fraktion, während etwa 4.000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren.
Unter den differentiell exprimierten Genen waren die Leydig-Zell-assoziierten Gene Hsd11b1 und Hsd3b6 in der positiven Fraktion angereichert. In der negativen Fraktion wurden die Sertoli-Zell-assoziierten Gene Desert Hedgehog und Gstm6 angereichert. Beim Vergleich der negativen Fraktion mit dem Input wurden nur wenige differentiell exprimierte Gene identifiziert.
Die quantitative RT-PCR in Echtzeit wurde verwendet, um die Expression von Schlüsselgenen in den positiven und negativen Fraktionen zu bestätigen. Ähnlich wie im Microarray-Assay wurden steroidogene Enzyme 3-beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und Cholesterin-Seitenkettenspaltungsenzym in der positiven Fraktion angereichert. In der Zwischenzeit wurden der Sertoli-Zellmarker SRY-Box-Transkriptionsfaktor neun und der Keimzellmarker synaptonemales Komplexprotein drei in der negativen Fraktion angereichert.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, einen frischen Homogenisierungsarbeitspuffer vorzubereiten Fügen Sie DTT, rekombinante Ribonuclease Cycloheximid und Proteinase-Inhibitor-Cocktail nur vor Gebrauch zur Homogenisierungs-Stammlösung hinzu. Es ist auch wichtig, frisches niedriges Salz und die hohen Salzwäschepuffer vor Gebrauch vorzubereiten.
