Das Protokoll schlägt vor, Tabakhornwurm als Insektenmodellsystem für präklinische Cannabinoidstudien zu verwenden. Dieses System ermöglicht es Forschern, akute und langfristige Reaktionen auf Cannabinoide leicht zu untersuchen. Das Insektenmodellsystem ermöglicht es Forschern, die therapeutischen Wirkungen von Cannabinoiden in einer großen Population innerhalb von drei bis vier Wochen mit weniger Arbeit und Kosten als andere Tiersysteme zu untersuchen.
Erhalten Sie 150 bis 200 lebensfähige M.sexta-Eier und weizenkeimbasierte künstliche Diäten. Legen Sie die Hornwurmeier in eine Polystyrol-Petrischale mit einer künstlichen Futterschicht auf Weizenkeimbasis und übertragen Sie die Eier in eine Insektenaufzuchtkammer, die bei 25 Grad Celsius mit 40 bis 60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Lassen Sie die Eier ein bis drei Tage in der Insektenzuchtkammer schlüpfen.
Um eine 200 Millimolar Cannabidiol-Stammlösung herzustellen, fügen Sie 1,26 Gramm Cannabidiolisolat mit mehr als 98% Reinheit in 20 Milliliter Ethanol oder 100% mittelkettigem Triglyceridöl hinzu. Fügen Sie fünf Milliliter und 10 Milliliter der 200 Millimolar Cannabidiol-Stammlösung zu den 1.000 Gramm einer künstlichen Diät für einen Millimolar bzw. zwei Millimolar Cannabidiol hinzu. Geben Sie 20 Gramm Kontrollfahrzeug und cannabidiolhaltige Medien auf den Boden des 50-Milliliter-Röhrchens.
Nach dem Zufallsprinzip etwa zwei Millimeter lange Larven im ersten Stadium einzeln in einem 50-Milliliter-Reagenzglas verteilen und mit einem perforierten Deckel oder Käsetuch abdecken. Züchten Sie sie in einer Insektenaufzuchtkammer, die bei 25 Grad Celsius mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten wird. Um das Larvenwachstum zu messen, zeichnen Sie die Anfangsmasse und -größe jeder Gruppe mit einer Analysenwaage bzw. einem Lineal auf und führen Sie die Larven in ihre jeweilige Ernährung ein.
Subtrahieren Sie die Masse der Larven bei jeder Messung in zweitägigen Intervallen von der Anfangsmasse, um die Massenzuwächse zwischen den Entwicklungsstadien der Larven zu bestimmen. Notieren Sie auch die Anzahl der Tage zwischen den Entwicklungsstadien des Stadiums, um Unterschiede im Entwicklungszeitraum bis zur Verpuppung zu verstehen. Um den Nahrungsverbrauch zu messen, notieren Sie die ersten Gramm Diät zu Beginn des Experiments und ziehen Sie sie von der verbleibenden Futtermenge ab, wenn die Larven in das vollständige Verpuppungsstadium eingetreten sind.
Lassen Sie das betroffene Insekt für die Larvenmobilität mindestens fünf Minuten lang an die Angstkonditionierungskammer gewöhnen und verfolgen Sie die Entfernungen, die die drei Gruppen der Insekten des fünften Stadiums fünf Minuten lang zurückgelegt haben. Führen Sie dann die Bewegungserkennungssoftware aus, um die Mobilitätsreaktion zu analysieren. Die künstlich gezüchteten Insekten zeigten die beste Wachstumsleistung.
Die Vehikelkontrolle, die 0,1% mittelkettiges Triglyceridöl als Lösemittel für CBD-Isolat verwendete, zeigte ebenfalls ein normales Wachstum ohne schädliche Auswirkungen. Eine hohe CBD-Dosis von zwei Millimetern induzierte jedoch einen Gewichtsverlust und führte zu einer höheren Sterblichkeitsrate als Kontroll- und Fahrzeuggruppen. M.sexta-Larven, die auf AD mit einem Millimeter CBD aufgezogen wurden, verzehrten mindestens 3,1-mal mehr Nahrung als diejenigen, die mit ethanolzugesetzter Diät aufgezogen wurden.
Der Nahrungskonsum der Insekten, die auf zwei millimolaren CBD-zugesetzten Medien aufgezogen wurden, unterschied sich jedoch nicht signifikant von den Larven, die auf reinen Ethanol-Diäten aufgezogen wurden. Der mobile Index der M.sexta-Larve, die unter verschiedenen Bedingungen aufgezogen wurde, zeigt, dass 1% Ethanol und eine millimolare CBD-behandelte Larve die Mobilität nicht beeinträchtigten. Die 2% Ethanol-Behandlungen erwiesen sich als tödlich.
Die Zugabe einer hohen Dosis CBD in AD mit 2% Ethanol stellte die geringe Mobilität wieder her. Sobald CBD zu Diäten hinzugefügt wurde, homogenisieren Sie die Diät-CBD-Mischung vollständig und züchten Insekten in der Insektenaufzuchtkammer, die bei 25 Grad Celsius mit 40 bis 60% Luftfeuchtigkeit gehalten wird, um einen Pilzausbruch zu vermeiden. Elektrophysiologische Reaktionen können auch mit den ventralen Kettenganglien überwacht werden, die von Manduca sexta seziert werden, um festzustellen, ob CBD das zentrale Nervensystem des Tabakhornwurms beeinflusst.
Das Insektenmodellsystem wird es den Forschern ermöglichen, die pharmazeutische Rolle anderer wichtiger und kleinerer Cannabinoide zu erforschen, indem sie über mehrere Generationen getestet werden, was ein experimentelles Design bei höheren Säugetieren ermöglicht.
