Il protocollo propone di utilizzare hornworm del tabacco come sistema modello di insetti per studi preclinici sui cannabinoidi. Questo sistema consente ai ricercatori di studiare prontamente le risposte acute e a lungo termine ai cannabinoidi. Il sistema di modelli di insetti consente ai ricercatori di studiare gli effetti terapeutici dei cannabinoidi in una vasta popolazione entro tre o quattro settimane con meno manodopera e costi rispetto ad altri sistemi animali.
Ottieni da 150 a 200 uova M.sexta vitali e diete artificiali a base di germe di grano. Posizionare le uova di hornworm in una capsula di Petri di polistirolo con uno strato di dieta artificiale a base di germe di grano e trasferire le uova in una camera di allevamento di insetti mantenuta a 25 gradi Celsius con un'umidità relativa dal 40 al 60%. Lasciare che le uova si schiudano per uno o tre giorni all'interno della camera di allevamento degli insetti.
Per preparare una soluzione madre di cannabidiolo da 200 millimolari, aggiungere 1,26 grammi di isolato di cannabidiolo di purezza superiore al 98% in 20 millilitri di etanolo o olio di trigliceridi a catena media al 100%. Aggiungere cinque millilitri e 10 millilitri della soluzione madre di cannabidiolo da 200 millimolari agli 1.000 grammi di una dieta artificiale per un millimolare e due millimolari di cannabidiolo, rispettivamente. Erogare 20 grammi di veicolo di controllo e mezzi contenenti cannabidiolo sul fondo del tubo da 50 millilitri.
Distribuire in modo casuale circa due larve di instar lunghe circa due millimetri singolarmente in una provetta da 50 millilitri e coprire con un coperchio perforato o una garza. Coltivali all'interno di una camera di allevamento di insetti mantenuta a 25 gradi Celsius con un ciclo luce-buio di 12 ore. Per misurare la crescita larvale, registrare la massa e le dimensioni iniziali di ciascun gruppo con un equilibrio analitico e un righello, rispettivamente, e introdurre le larve nelle rispettive diete.
Sottrarre la massa delle larve ad ogni misurazione a intervalli di due giorni dalla massa iniziale per determinare i guadagni di massa tra gli stadi di sviluppo delle larve. Inoltre, registra il numero di giorni tra le fasi di sviluppo instar per comprendere le differenze nel periodo di sviluppo fino alla pupa. Per misurare il consumo di dieta, registrare i grammi iniziali di dieta all'inizio dell'esperimento e sottrarlo dalla quantità rimanente di dieta quando le larve sono entrate nella fase completa di pupa.
Per la misurazione della mobilità larvale, consentire all'insetto sottoposto di acclimatarsi alla camera di condizionamento della paura per almeno cinque minuti e tracciare le distanze percorse dai tre gruppi di insetti instar di quinto per cinque minuti. Quindi, eseguire il software di rilevamento del movimento per analizzare la risposta di mobilità. Gli insetti allevati con una dieta artificiale hanno mostrato le migliori prestazioni di crescita.
Il controllo del veicolo che utilizzava lo 0,1% di olio di trigliceridi a catena media come agente di dissoluzione per l'isolato di CBD ha anche mostrato una crescita normale senza effetti dannosi. Tuttavia, un'alta dose di CBD di due millimetri ha indotto la perdita di peso e ha portato a un tasso di mortalità più elevato rispetto ai gruppi di controllo e veicoli. Le larve di M.sexta allevate con AD con un millimetro di CBD hanno consumato una dieta almeno 3,1 volte superiore rispetto a quelle allevate con una dieta con aggiunta di etanolo.
Tuttavia, il consumo dietetico degli insetti allevati con due mezzi millimolari aggiunti al CBD non era significativamente diverso dalle larve allevate con diete a base di solo etanolo. L'indice mobile della larva di M.sexta allevata in condizioni diverse mostra che l'1% di etanolo e una larva millimolare trattata con CBD non hanno influenzato la mobilità. I trattamenti con etanolo al 2% si sono rivelati letali.
L'aggiunta di un'alta dose di CBD in AD contenente il 2% di etanolo ha ripristinato la bassa mobilità. Una volta che il CBD viene aggiunto alle diete, omogeneizzare completamente la miscela di CBD dietetica e far crescere gli insetti nella camera di allevamento degli insetti mantenuta a 25 gradi Celsius con un'umidità dal 40 al 60% per evitare un'epidemia fungina. Le risposte elettrofisiologiche possono anche essere monitorate con i gangli della catena ventrale sezionati da Manduca sexta per determinare se il CBD influisce sul sistema nervoso centrale del hornworm del tabacco.
Il sistema di modelli di insetti consentirà ai ricercatori di esplorare i ruoli farmaceutici di altri cannabinoidi maggiori e minori testando su più generazioni, consentendo un disegno sperimentale nei mammiferi superiori.
