Dieses Protokoll beschreibt eine hochgradig reproduzierbare Methode zur funktionellen und molekularen Bewertung der parakrinen nicht-kanonischen Wnt-Signalisierung in jeder Zellpopulation von Interesse. Funktionelle und molekulare Bewertungen werden in derselben Zellpopulation durchgeführt und können angewendet werden, um jede Komponente des Wnt/PCP-Signalwegs zu untersuchen. Um zu beginnen, resuspendieren Sie die zuvor pelletierte C2C12-Zelle in 10 Milliliter C2C12-Medium.
Um die Zellen im Verhältnis 1:20 zu verdünnen, fügen Sie 0,5 Milliliter Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 9,5 Milliliter frischem C2C12-Medium hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer serologischen Pipette unter Verwendung einer P1000-Pipette, geben Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung eines neuen Vierkammerbrunnens und legen Sie ihn in den Inkubator. Für die Beschichtung von O9-1-Zelleinsätzen resuspendieren Sie das O9-1-Zellpellet in 10 Milliliter O9-1-Wachstumsmedium. Und ähnlich wie bei der C2C12-Zellverdünnung verdünnen Sie die O9-1-Zellen im Verhältnis 1:20.
Als nächstes platzieren Sie einen einzelnen durchlässigen Einsatz in jeder Vertiefung eines neuen Vierkammerbrunnens, der mit einem Milliliter O9-1-Wachstumsmedium gefüllt ist. Fügen Sie jedem Einsatz 300 Mikroliter der verdünnten O9-1-Zellsuspension hinzu und stellen Sie sicher, dass der Einsatz vollständig eingetaucht ist. Dann inkubieren Sie das Bohrloch bei 37 Grad Celsius.
Um einen siRNA-Knockdown in den O9-1-Zellen durchzuführen, verdünnen Sie die siRNA und das Transfektionsreagenz im reduzierten Serummedium gemäß den Empfehlungen des Herstellers in den gewünschten Konzentrationen. Mischen Sie vorsichtig die verdünnte siRNA und das Transfektionsreagenz und inkubieren Sie die Mischung sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 18 bis 24 Stunden Zellplattierung fügen Sie die siRNA-Lipidkomplexe zu den O9-1-Zelleinsätzen hinzu und inkubieren für etwa 34 bis 48 Stunden.
Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80% erreicht haben, entfernen Sie das Medium aus der C2C12-Kammer und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Beginnen Sie nach dem Entfernen des PBS mit dem Kratzen der Zellen, indem Sie eine sterile P10-Pipettenspitze fest in eine Richtung führen, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen. Sobald die Zellen zerkratzt sind, fügen Sie schnell einen Milliliter PBS hinzu.
Schalten Sie als nächstes den Computer und das Mikroskop ein. Platzieren Sie den Kammerschieber auf der Bühne und drehen Sie das Objektivrad auf 5-fache Vergrößerung. Öffnen Sie die Imaging-Software.
Klicken Sie auf die Registerkarte Kamera und dann auf die Schaltfläche Live, um die Zellen auf der Registerkarte AxioCam IC anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass der Lichtfilter ganz herausgezogen ist, damit Licht auf die Kamera und den Computerbildschirm gelangen kann, bewegen oder drehen Sie den Kammerschieber manuell, um den Wundbereich in der Mitte des Livebildes auf der AxioCam IC-Lasche zu positionieren. Um Bilder aufzunehmen, klicken Sie auf Ausrichten, um eine neue Registerkarte neben der Registerkarte AxioCam IC zu öffnen, die das Bild enthält.
Um dieses Standbild zu speichern, klicken Sie auf die Datei, wählen Sie Speichern unter, wählen Sie Desktop in der Leiste auf der linken Seite, um die Datei auf dem Desktop zu speichern, geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein und speichern Sie die Abbildung im czi-Dateiformat. Um das Bild als TIFF-Datei zu speichern, klicken Sie auf Datei, wählen Sie Speichern unter, und geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Als Typ speichern" und wählen Sie tiff aus dem Dropdown-Menü.
Positionieren Sie den Kammerschieber manuell, um zwei bis drei weitere Bilder an anderen Stellen der Wunde im selben Vertiefung aufzunehmen. Entfernen Sie nach der Bildgebung das PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie einen Milliliter C2C12-Medium hinzu. Setzen Sie das Kokultursystem zusammen, indem Sie die Einsätze mit den O9-1-Zellen manuell in jede Vertiefung der Kammermulde legen.
Drücken Sie die Einsätze vorsichtig in die Vertiefung, so dass der Boden des Einsatzes knapp über den darunter liegenden C2C12-Zellen liegt. Bringen Sie die Brunneneinsatzkonstrukte in den Inkubator zurück und lassen Sie die Zellen insgesamt neun bis 12 Stunden wandern. Um die optimale Migrationszeit zu bestimmen, überprüfen Sie die Zellen sechs Stunden nach der Wundbildung, danach alle zwei bis drei Stunden.
Beenden Sie das Experiment, wenn die Zellen unter Kontrollbedingungen die Wunde vollständig bedecken. Beginnen Sie mit der Beendigung des Migrationsassays und der Dekonstruktion des Bohrlocheinsatzes, indem Sie die O9-1-Zelleinsätze nach neun bis 12 Stunden der Migrationsperiode entfernen. Saugen Sie das C2C12-Medium vorsichtig ab.
Fügen Sie 0,5 Milliliter PBS in die Kammermulden hinzu und machen Sie endgültige Bilder der Zellen nach der Migration. Saugen Sie alle PBS, die mit Medium gemischt sind, vorsichtig ab und entfernen Sie die Kunststoffkammern aus den Kammerschächten gemäß den Kit-Anweisungen. Verlassen des darunter liegenden Objektträgers mit den C2C12-Zellen.
Zur Immunfärbung sofort den Objektträger mit 4% paraformem Aldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann Paraformaldehyd entfernen und den Objektträger mit 0,1% Triton X-100 PBST für 15 Minuten bei Raumtemperatur waschen. Nach 15 Minuten PBST ausgießen und den Objektträger zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten waschen.
Erstellen Sie dann eine hydrophobe Grenze mit einem hydrophoben Stift um den Objektträger, um zu verhindern, dass Lösungen aus dem Objektträger verschüttet werden, wodurch eine Störung der Adhärenzzellen verhindert wird. Als nächstes fügen Sie dem Objektträger innerhalb der hydrophoben Grenze etwa 0,5 Milliliter 1% BSA-Blockierungslösung hinzu und inkubieren den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Objektträgerkammer. Am Ende der Inkubation die blockierende Lösung entfernen und den Phalloidin-Antikörper zu diesem Objektträger innerhalb der hydrophoben Grenze hinzufügen und bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren.
Am nächsten Tag legen Sie das Dia in einen Diahalter, der vor Lichteinwirkung geschützt ist. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie DAPI-haltiges Montagemedium hinzu, montieren Sie die Objektträger mit Glasabdeckungsgläsern und erfassen Sie die Zellen mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop.
In der vorliegenden Studie beschleunigte die Zugabe von rekombinantem Wnt5a zu Co-Kultur-Wells die Myoblastenmigration mit vollständiger Erholung einiger Gebiete um neun Stunden. Die wandernden Myoblasten zeigten unter allen drei Bedingungen eine normale wandernde Zellmorphologie, einschließlich gut geformter und hervorstehender Filopodien und Lamellipodien und asymmetrischer Polarisation von Aktin-Zytoskelettprojektionen. Die parakrine Wirkung von NCC-abgeleitetem Wnt5a auf die Myoblastenmigration wurde untersucht.
Die Behandlung mit 50 nanomolaren siRNA gegen Wnt5a reduzierte die Wnt5a-Genexpression um 64% im Vergleich zur Negativkontrolle. Die Migration von C2C12-Meilenblasten mit signifikant reduziertem Wnt5a-Knockdown in NCCs und die Zugabe von exogenem rekombinantem Wnt5a retteten dieses Migrationsdefizit und den morphologischen Defekt in diesen Myoblasten. Um die Signalempfangszellmechanismen im parakrinen Modell besser zu verstehen, wurde der ROR2-Rezeptor abgeschaltet und die Genexpression um 54% reduziertKnockdown von ROR2 in Myoblasten reduziert ihre Migrationskapazität trotz des Vorhandenseins von NCCs.
Exogenes rekombinantes Wnt5a konnte die Migration der Myoblasten nach dem ROR2-Knockdown nicht retten, was darauf hindeutet, dass die ROR2-Depletion die Fähigkeit von Myoblasten, Wnt5a-Signale zu empfangen, stört. Kulturzellen auf ausreichende Dichte kratzen mit P10-Spitze nur einmal montiert und demontiert Co-Kultursystem mit Vorsicht, ohne die darunter liegende Zelle zu stören. Diese Technik wurde als Machbarkeitsnachweis verwendet, um eine spezifische molekulare Signalachse innerhalb des komplexen Wnt/PCP-Signalwegs mit Relevanz für die Neuralleistenzell- und Zweitherrenfeldbiologie zu untersuchen.
