Этот протокол описывает высоковоспроизводимый метод функциональной и молекулярной оценки паракринной неканонической передачи сигналов Wnt в любой интересующей клеточной популяции. Функциональные и молекулярные оценки выполняются в одной и той же клеточной популяции и могут быть применены для изучения любого компонента пути Wnt/PCP. Для начала повторно суспендируйте ранее гранулированную ячейку C2C12 в 10 миллилитрах среды C2C12.
Чтобы разбавить клетки в соотношении 1:20, добавляют 0,5 миллилитра клеточной суспензии в 15-миллилитровую трубку, содержащую 9,5 миллилитра свежей среды C2C12 и осторожно смешивают с серологической пипеткой с помощью пипетки P1000, добавляют по одному миллилитру разбавленной клеточной суспензии к каждой лунке нового четырехкамерного колодца и помещают его в инкубатор. Для покрытия клеточных вставок O9-1 повторно суспендируйте гранулу клетки O9-1 в 10 миллилитрах питательной среды O9-1. И подобно разведению клеток C2C12, разбавляют клетки O9-1 в соотношении 1:20.
Затем поместите одну проницаемую вставку внутри каждой лунки нового четырехкамерного колодца, заполненного одним миллилитром питательной среды O9-1. Добавьте 300 микролитров разбавленной клеточной суспензии O9-1 к каждой вставке и убедитесь, что вставка полностью погружена. Затем инкубируют лунку при 37 градусах Цельсия.
Для выполнения нокдауна siRNA в клетках O9-1 разводят siRNA и трансфекционный реагент в восстановленной сывороточной среде согласно рекомендациям производителя в нужных концентрациях. Осторожно смешайте разбавленную siRNA и трансфекционный реагент и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение семи минут. После 18-24 часов клеточного покрытия добавляют липидные комплексы siRNA к клеточным вставкам O9-1 и инкубируют в течение примерно 34-48 часов.
Когда клетки достигнут слияния от 70 до 80%, удалите среду из камеры C2C12 и промыть клетки один раз PBS. После удаления PBS начните царапать клетки, проводя стерильный наконечник пипетки P10 твердо в одном направлении, чтобы охватить всю длину или ширину монослоя ячейки. Как только клетки поцарапаются, быстро добавьте один миллилитр PBS.
Далее включите компьютер и микроскоп. Поместите затвор камеры на сцену и поверните объектив на 5-кратное увеличение. Откройте программное обеспечение для создания образов.
Перейдите на вкладку камеры, а затем нажмите кнопку Live, чтобы визуализировать ячейки на вкладке AxioCam IC. Убедитесь, что световой фильтр вытянут наружу, чтобы свет пропускался на камеру и экран компьютера, вручную переместите или поверните слайд камеры, чтобы расположить раневую область в центре живого изображения на вкладке AxioCam IC. Чтобы сделать снимки, нажмите кнопку привязки, чтобы открыть новую вкладку рядом с вкладкой AxioCam IC, содержащей изображение.
Чтобы сохранить это неподвижное изображение, нажмите на файл, выберите сохранить как, выберите рабочий стол на панели слева, чтобы сохранить файл на рабочем столе, введите имя файла в поле имени файла и сохраните рисунок в формате файла czi. Чтобы сохранить изображение в формате tiff, щелкните файл, выберите сохранить как, введите имя файла в поле имя файла. Нажмите кнопку Сохранить как тип и выберите tiff в раскрывающемся меню.
Вручную переместите слайд камеры, чтобы сделать еще два-три изображения в других точках раны в том же колодце. После получения изображения удалите PBS из каждой скважины и добавьте один миллилитр среды C2C12. Соберите систему кокультуры колодезных вставок, вручную разместив вставки, содержащие ячейки O9-1, в каждую скважину камерного колодца.
Осторожно протолкните вставки вниз в колодец, чтобы нижняя часть вставки располагалась чуть выше нижележащих ячеек C2C12. Верните конструкции вставки колодца в инкубатор и позвольте клеткам мигрировать в общей сложности от девяти до 12 часов. Чтобы определить оптимальное время миграции, проверяйте клетки через шесть часов после создания раны, затем каждые два-три часа после этого.
Заканчивают эксперимент, когда клетки в контрольных условиях полностью покрывают рану. Начните завершение миграционного анализа и деконструкцию системы вставки скважины, удалив вставки клеток O9-1 через девять-12 часов периода миграции. Тщательно аспирируйте среду C2C12.
Добавьте 0,5 миллилитра PBS в камерные скважины и сделайте окончательные изображения клеток после миграции. Тщательно аспирируйте все PBS, смешанные со средой, и извлеките пластиковые камеры из камерных колодцев, используя инструкции по комплекту. Оставление базового слайда, содержащего ячейки C2C12.
Для иммуноокрашивания немедленно инкубируйте горку с 4% параформным альдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем удалите параформальдегид и промойте горку 0,1% Triton X-100, содержащую PBST, в течение 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут вылейте ПБСТ и дважды вымойте горку PBS в течение 10 минут каждая.
Затем создайте гидрофобную границу гидрофобной ручкой вокруг слайда, чтобы предотвратить разлив растворов с слайда, предотвращая нарушение клеток адгезии. Затем добавьте приблизительно 0,5 миллилитра 1% раствора блокировки BSA к слайду в пределах гидрофобной границы и инкубируйте слайд в течение одного часа при комнатной температуре в увлажненной камере слайда. В конце инкубации удалите блокирующий раствор и добавьте фаллоидиновое антитело к этому слайду в пределах гидрофобной границы и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
На следующий день поместите слайд в держатель слайда, защищенный от воздействия света. Трижды промыть клетки PBS в течение 10 минут каждая при комнатной температуре. Добавьте монтажную среду, содержащую DAPI, установите слайды со стеклянными крышками и захватите ячейки с помощью стандартного флуоресцентного микроскопа.
В настоящем исследовании добавление рекомбинантного Wnt5a в кокультурные скважины ускорило миграцию миобластов с полным восстановлением некоторых участков на девять часов. Мигрирующие миобласты во всех трех условиях демонстрировали нормальную мигрирующую клеточную морфологию, включая хорошо сформированные и выступающие филоподии и ламеллиподии и асимметричную поляризацию актиновых цитоскелетных проекций. Изучен паракринный эффект Wnt5a, полученного из NCC, на миграцию миобластов.
Лечение 50 наномолярными siRNA против Wnt5a снижало экспрессию гена Wnt5a на 64% по сравнению с отрицательным контролем. Миграция взрывов C2C12 миль со значительным снижением после нокдауна Wnt5a в NCC и добавление экзогенного рекомбинантного Wnt5a спасли этот миграционный дефицит и морфологический дефект в этих миобластах. Чтобы лучше понять механизмы приемных сигналов клеток в паракринной модели, рецептор ROR2 был сбит, а экспрессия генов снижена на 54% Нокдаун ROR2 в миобластах снижает их миграционную способность, несмотря на наличие NCC.
Экзогенный рекомбинантный Wnt5a не смог спасти миграцию миобластов после нокдауна ROR2, предполагая, что истощение ROR2 нарушает способность миобластов получать сигналы Wnt5a. Культивирование клеток до достаточной плотности царапины с наконечником P10 только один раз собрать и несобранную систему кокультуры с осторожностью, не нарушая подлежащую клетку. Этот метод был использован в качестве доказательства концепции для изучения конкретной молекулярной сигнальной оси в пределах сложного пути Wnt / PCP, имеющего отношение к биологии нервного гребня и поля второго сердца.
