פרוטוקול זה מתווה שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להערכה פונקציונלית ומולקולרית של אותות Wnt לא קנוניים בכל אוכלוסיית תאים מעניינת. הערכות פונקציונליות ומולקולריות מבוצעות באותה אוכלוסיית תאים וניתן ליישם אותן כדי לחקור כל רכיב של מסלול Wnt/PCP. כדי להתחיל, להשעות את התא C2C12 בעבר גלולה ב 10 מיליליטר של C2C12 בינוני.
כדי לדלל את התאים ביחס של 1:20, להוסיף 0.5 מיליליטר של תרחיף התא בצינור 15 מיליליטר המכיל 9.5 מיליליטר של מדיום C2C12 טרי ולערבב בעדינות עם פיפטה סרולוגית באמצעות פיפטה P1000, להוסיף מיליליטר אחד של תרחיף התא המדולל לכל באר חדשה של ארבעה תאים ולהניח אותו באינקובטור. עבור ציפוי O9-1 מוסיף תאים, השהה את גלולת התא O9-1 ב 10 מיליליטר של מדיום הצמיחה O9-1. ובדומה לדילול תאי C2C12, יש לדלל את תאי O9-1 ביחס של 1:20.
לאחר מכן, הנח תוסף חדיר יחיד בתוך כל באר של ארבעה תאים חדשים מלאים במיליליטר אחד של מדיום צמיחה O9-1. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תרחיף תאי O9-1 המדולל לכל תוספת וודאו שהתוסף שקוע לחלוטין. ואז לדגור את הבאר ב 37 מעלות צלזיוס.
כדי לבצע נוק-דאון של siRNA בתאי O9-1, יש לדלל את ה-siRNA ואת מגיב הטרנספקציה במדיום הסרום המופחת בהתאם להמלצות היצרן בריכוזים הרצויים. מערבבים בעדינות את ה-siRNA המדולל ואת מגיב הטרנספקציה ומדגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות. לאחר 18 עד 24 שעות של ציפוי תאים, הוסיפו את קומפלקסי השומנים של siRNA לתוספות התאים O9-1 ודגרו במשך כ-34 עד 48 שעות.
כאשר התאים מגיעים למפגש של 70 עד 80%, הסר את המדיום מתא C2C12 היטב ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר הסרת PBS, התחל לגרד את התאים על ידי העברת קצה פיפטה P10 סטרילי בחוזקה בכיוון אחד כדי להשתרע על כל האורך או הרוחב של מונולייר התא. לאחר שהתאים נשרטים, הוסף במהירות מיליליטר אחד של PBS.
לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ. הנח את שקופית התא על הבמה וסובב את חוגת המטרה להגדלה של 5X. פתח את תוכנת ההדמיה.
לחץ על כרטיסיית המצלמה ולאחר מכן לחץ על לחצן Live כדי להציג באופן חזותי את התאים בכרטיסיה AxioCam IC. ודא שמסנן האור נמשך כל הדרך החוצה כדי לאפשר לאור לעבור למצלמה ולמסך המחשב, הזז או סובב ידנית את שקופית התא כדי למקם את אזור הפצע במרכז התמונה החיה בכרטיסיית AxioCam IC. כדי לצלם תמונות, לחץ על הצמד כדי לפתוח כרטיסייה חדשה לצד הכרטיסיה AxioCam IC המכילה את התמונה.
כדי לשמור תמונת סטילס זו, לחץ על הקובץ, בחר שמירה בשם, בחר שולחן עבודה בסרגל בצד שמאל כדי לשמור את הקובץ בשולחן העבודה, הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ ושמור את הדמות בתבנית קובץ czi. כדי לשמור את התמונה כ- tiff, לחץ על קובץ, בחר שמירה בשם, הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. לחץ על הלחצן שמור כסוג ובחר tiff מהתפריט הנפתח.
מקם מחדש באופן ידני את שקופית החדר כדי לצלם שתיים עד שלוש תמונות נוספות בנקודות אחרות של הפצע באותה באר. לאחר ההדמיה, הסר את ה- PBS מכל באר והוסף מיליליטר אחד של מדיום C2C12. הרכיבו את מערכת התרבית המשותפת של הבאר על ידי מיקום ידני של התוספות המכילות את תאי O9-1 בכל באר של החדר.
דחפו בעדינות את התוספות כלפי מטה לתוך הבאר, כך שתחתית התוסף ממוקמת בדיוק מעל תאי C2C12 שמתחת. החזירו את מבני הבאר לאינקובטור ואפשרו לתאים לנדוד במשך תשע עד 12 שעות בסך הכל. כדי לקבוע את זמן הנדידה האופטימלי, בדקו את התאים שש שעות לאחר יצירת הפצע, ולאחר מכן כל שעתיים-שלוש.
סיים את הניסוי כאשר התאים בתנאי בקרה מכסים לחלוטין את הפצע. התחל את סיום בדיקת ההעברה והכנס היטב את פירוק המערכת על-ידי הסרת תוספות התאים O9-1 לאחר תשע עד 12 שעות מתקופת ההעברה. שאפו בזהירות את מדיום C2C12.
הוסף 0.5 מיליליטר של PBS לבארות התא וצלם תמונות סופיות של תאים לאחר נדידה. שאפו בזהירות את כל PBS מעורבב עם בינוני והסירו את תאי הפלסטיק מבארות התא באמצעות הוראות הערכה. השארת השקופית שמתחתיה המכילה את תאי C2C12.
עבור מכתמי חיסון, מיד לדגור את השקופית עם 4% paraform aldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר paraformaldehyde ולשטוף את השקופית עם 0.1% Triton X-100 המכיל PBST במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, יש לשפוך את ה-PBST ולשטוף את המגלשה פעמיים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד.
לאחר מכן צור גבול הידרופובי עם עט הידרופובי סביב המגלשה כדי למנוע שפיכת תמיסות מהשקופית ומניעת הפרעה לתאי ההדבקה. לאחר מכן, הוסיפו כ-0.5 מיליליטר של תמיסת חסימה של 1% BSA לשקופית בגבול ההידרופובי ודגרו את המגלשה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא שקופיות לח. בתום הדגירה, הסירו את התמיסה החוסמת והוסיפו את נוגדן הפלואידין לשקופית זו בתוך הגבול ההידרופובי, ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, מקם את השקופית במחזיק שקופיות המוגן מפני חשיפה לאור. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. הוסף מדיום הרכבה המכיל DAPI, הרכב את השקופיות עם תלושי כיסוי זכוכית ולכוד את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.
במחקר הנוכחי, תוספת של Wnt5a רקומביננטי לבארות תרבות משותפת האיצה את נדידת מיובלסט עם התאוששות מלאה של אזורים מסוימים בתשע שעות. המיובלסטים הנודדים בכל שלושת התנאים הציגו מורפולוגיה תאית נודדת תקינה, כולל פילופודיה ולמליפודיה בנויות היטב ובולטות וקיטוב אסימטרי של היטלים ציטוסקטליים של אקטין. נבדקה ההשפעה הפראקרנית של Wnt5a שמקורה ב-NCC על נדידת מיובלסט.
טיפול ב-50 ננומולר siRNA נגד Wnt5a הפחית את ביטוי הגנים Wnt5a ב-64% בהשוואה לבקרה שלילית. נדידת פיצוצי C2C12 מייל עם הפחתה משמעותית בעקבות נוק-דאון Wnt5a ב-NCCs ותוספת של רקומביננטי אקסוגני Wnt5a הצילו את הגירעון הנודד הזה ואת הפגם המורפולוגי במיובלסטים אלה. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני התא הקולטים במודל הפראקריני, קולטן ROR2 הופל וביטוי הגנים הופחת ב-54% Knockdown של ROR2 במיובלסטים מפחית את יכולת הנדידה שלהם למרות נוכחותם של NCCs.
רקומביננטי אקסוגני Wnt5a לא הצליח להציל את נדידת מיובלסט לאחר הפלת ROR2 המצביעה על כך שהתרוקנות ROR2 משבשת את יכולתם של מיובלסטים לקלוט אותות Wnt5a. תאי תרבית לצפיפות נאותה עם קצה P10 רק לאחר הרכבה ופירוק מערכת תרבית משותפת בזהירות מבלי לשבש את התא הבסיסי. טכניקה זו שימשה כהוכחת היתכנות כדי לחקור ציר איתות מולקולרי ספציפי בתוך מסלול Wnt/PCP המורכב עם רלוונטיות לביולוגיה של תאי פסגה עצביים ושדה לב שני.
