Bu protokol, ilgilenilen herhangi bir hücre popülasyonunda parakrin kanonik olmayan Wnt sinyallemesini fonksiyonel ve moleküler olarak değerlendirmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntemi özetlemektedir. Fonksiyonel ve moleküler değerlendirmeler aynı hücre popülasyonunda gerçekleştirilir ve Wnt / PCP yolunun herhangi bir bileşenini incelemek için uygulanabilir. Başlamak için, daha önce peletlenmiş C2C12 hücresini 10 mililitre C2C12 ortamında yeniden askıya alın.
Hücreleri 1:20 oranında seyreltmek için, 9,5 mililitre taze C2C12 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bir P1000 pipet kullanarak serolojik bir pipetle hafifçe karıştırın, seyreltilmiş hücre süspansiyonunun bir mililitresini yeni bir dört odacıklı kuyucuğun her bir kuyucuğuna ekleyin ve inkübatöre yerleştirin. O9-1 hücre eklerini kaplamak için, O9-1 hücre peletini 10 mililitre O9-1 büyüme ortamında yeniden askıya alın. Ve C2C12 hücre seyreltmesine benzer şekilde, O9-1 hücrelerini 1:20 oranında seyreltin.
Daha sonra, bir mililitre O9-1 büyüme ortamı ile doldurulmuş yeni dört odacıklı kuyucuğun her bir kuyucuğunun içine tek bir geçirgen uç yerleştirin. Her bir kesici uca 300 mikrolitre seyreltilmiş O9-1 hücre süspansiyonu ekleyin ve kesici ucun tamamen suya batırıldığından emin olun. Sonra kuyuyu 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
O9-1 hücrelerinde siRNA nakavtı gerçekleştirmek için, siRNA ve transfeksiyon reaktifini, üreticinin tavsiyelerine göre indirgenmiş serum ortamında istenen konsantrasyonlarda seyreltin. Seyreltilmiş siRNA ve transfeksiyon reaktifini nazikçe karıştırın ve karışımı yedi dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 18 ila 24 saatlik hücre kaplamasından sonra, siRNA lipit komplekslerini O9-1 hücre eklerine ekleyin ve yaklaşık 34 ila 48 saat boyunca inkübe edin.
Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, ortamı C2C12 odasından iyice çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, tek katmanlı hücrenin tüm uzunluğunu veya genişliğini kapsayacak şekilde steril bir P10 pipet ucunu sıkıca tek bir yönde geçirerek hücreleri çizmeye başlayın. Hücreler çizildikten sonra, hızlı bir şekilde bir mililitre PBS ekleyin.
Ardından, bilgisayarı ve mikroskobu açın. Oda kızağını sahne alanına yerleştirin ve objektif kadranı 5X büyütmeye döndürün. Görüntüleme yazılımını açın.
Kamera sekmesini tıklatın ve ardından AxioCam IC sekmesindeki hücreleri görselleştirmek için Canlı düğmesini tıklatın. Işığın kameraya ve bilgisayar ekranına geçmesine izin vermek için ışık filtresinin tamamen dışarı çekildiğinden emin olun, AxioCam IC sekmesindeki canlı görüntünün ortasındaki yara alanını konumlandırmak için hazne kızağını manuel olarak hareket ettirin veya döndürün. Görüntü çekmek için, görüntüyü içeren AxioCam IC sekmesinin yanında yeni bir sekme açmak üzere tuttur'u tıklatın.
Bu durağan görüntüyü kaydetmek için dosyaya tıklayın, farklı kaydet'i seçin, dosyayı masaüstüne kaydetmek için soldaki çubukta masaüstünü seçin, dosya adı kutusuna dosya adını girin ve şekli czi dosya biçiminde kaydedin. Resmi tiff olarak kaydetmek için dosya'yı tıklatın, Farklı kaydet'i seçin, dosya adı kutusuna dosya adını girin. Kayıt türü düğmesini tıklayın ve açılır menüden tiff'i seçin.
Aynı kuyucuktaki yaranın diğer noktalarında iki ila üç görüntü daha çekmek için oda kızağını manuel olarak yeniden konumlandırın. Görüntülemeden sonra, PBS'yi her bir oyuktan çıkarın ve bir mililitre C2C12 ortamı ekleyin. O9-1 hücrelerini içeren kesici uçları haznenin her bir kuyucuğuna manuel olarak yerleştirerek kuyu kesici uç ko-kültür sistemini monte edin.
Kesici uçları yavaşça kuyunun içine doğru itin, böylece kesici ucun alt kısmı alttaki C2C12 hücrelerinin hemen üzerine oturur. Kuyu ekleme yapılarını inkübatöre geri döndürün ve hücrelerin toplam dokuz ila 12 saat boyunca göç etmesine izin verin. En uygun göç süresini belirlemek için, hücreleri yara oluşumundan sonraki altı saatte, daha sonra her iki ila üç saatte bir kontrol edin.
Kontrol koşullarındaki hücreler yarayı tamamen kapladığında deneyi sonlandırın. Geçiş testinin sonlandırılmasına başlayın ve geçiş döneminin dokuz ila 12 saatinden sonra O9-1 hücre eklerini çıkararak sistem yapısökümünü iyi yerleştirin. C2C12 ortamını dikkatlice aspire edin.
Oda kuyularına 0,5 mililitre PBS ekleyin ve göçü takiben hücrelerin son görüntülerini alın. Ortamla karıştırılmış tüm PBS'leri dikkatlice aspire edin ve kit talimatlarını kullanarak plastik odaları oda kuyularından çıkarın. C2C12 hücrelerini içeren temel slaytı bırakarak.
İmmün boyama için, slaytı derhal oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraform aldehit ile inkübe edin. Daha sonra paraformaldehiti çıkarın ve slaytı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBST içeren% 0.1 Triton X-100 ile yıkayın. 15 dakika sonra, PBST'yi dökün ve slaytı PBS ile her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
Ardından, aderans hücrelerinin bozulmasını önleyen çözeltilerin slayttan dökülmesini önlemek için slaytın etrafında hidrofobik bir kalem bulunan hidrofobik bir sınır oluşturun. Daha sonra, hidrofobik sınır içindeki slayta yaklaşık 0,5 mililitre% 1 BSA blokaj çözeltisi ekleyin ve slaytı nemlendirilmiş bir slayt odasında oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve falloidin antikorunu hidrofobik sınır içindeki bu slayta ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, slaytı ışığa maruz kalmaktan korunan bir slayt tutucuya yerleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. DAPI içeren montaj ortamı ekleyin, slaytları cam kapak fişleriyle monte edin ve standart bir floresan mikroskobu kullanarak hücreleri yakalayın.
Bu çalışmada, ko-kültür kuyularına rekombinant Wnt5a'nın eklenmesi, bazı bölgelerin dokuz saat tamamen iyileşmesiyle miyoblast göçünü hızlandırmıştır. Her üç koşuldaki göçmen miyoblastlar, iyi biçimlendirilmiş ve çıkıntılı filopodia ve lamellipodia ve aktin sitoiskelet projeksiyonlarının asimetrik polarizasyonu dahil olmak üzere normal göçmen hücresel morfolojiyi sergiledi. NCC kaynaklı Wnt5a'nın miyoblast göçü üzerindeki parakrin etkisi incelenmiştir.
Wnt5a'ya karşı 50 nanomolar siRNA ile tedavi, Wnt5a gen ekspresyonunu negatif kontrole kıyasla% 64 oranında azaltmıştır. NCC'lerde Wnt5a nakavtını takiben C2C12 mil patlamalarının göçü ve eksojen rekombinant Wnt5a'nın eklenmesi, bu miyoblastlardaki bu göç açığını ve morfolojik kusuru kurtardı. Parakrin modelindeki sinyal alan hücre mekanizmalarını daha iyi anlamak için, ROR2 reseptörü devrildi ve gen ekspresyonu% 54 oranında azaltıldı Miyoblastlarda ROR2'nin yıkılması, NCC'lerin varlığına rağmen göç kapasitelerini azaltır.
Eksojen rekombinant Wnt5a, ROR2 yıkımının miyoblastların Wnt5a sinyallerini alma yeteneğini bozduğunu düşündüren ROR2 nakavtından sonra miyoblast göçünü kurtaramadı. Kültür hücreleri yeterli yoğunluğa sahip P10 ucu ile çizilir ancak bir kez monte edilir ve altta yatan hücreyi bozmadan ko-kültür sistemi ile özenle monte edilir. Bu teknik, karmaşık Wnt / PCP yolu içindeki spesifik bir moleküler sinyal eksenini nöral krest hücresi ve ikinci kalp alanı biyolojisi ile ilgili olarak incelemek için bir kavram kanıtı olarak kullanılmıştır.
