Este protocolo descreve um método altamente reprodutível para avaliar funcional e molecularmente a sinalização Wnt não canônica parácrina em qualquer população celular de interesse. Avaliações funcionais e moleculares são realizadas na mesma população celular e podem ser aplicadas para estudar qualquer componente da via Wnt/PCP. Para começar, ressuspeite a célula C2C12 previamente peletizada em 10 mililitros de meio C2C12.
Para diluir as células na proporção de 1:20, adicionar 0,5 mililitros de suspensão celular em um tubo de 15 mililitros contendo 9,5 mililitros de meio C2C12 fresco e misturar suavemente com uma pipeta sorológica usando uma pipeta P1000, adicionar um mililitro da suspensão celular diluída a cada poço de um novo poço de quatro câmaras e colocá-lo na incubadora. Para chapear as inserções de células de O9-1, ressussuscite o pellet de célula de O9-1 em 10 mililitros de meio de crescimento de O9-1. E semelhante à diluição das células C2C12, dilua as células O9-1 na proporção de 1:20.
Em seguida, coloque uma única inserção permeável dentro de cada poço de um novo poço de quatro câmaras preenchido com um mililitro de meio de crescimento O9-1. Adicione 300 microlitros da suspensão de células O9-1 diluídas a cada pastilha e certifique-se de que a pastilha está completamente submersa. Em seguida, incube o poço a 37 graus Celsius.
Para realizar a derrubada de siRNA nas células de O9-1, dilua o siRNA e o reagente de transfecção no meio sérico reduzido de acordo com as recomendações do fabricante nas concentrações desejadas. Misture suavemente o siRNA diluído e o reagente de transfecção e incube a mistura à temperatura ambiente durante sete minutos. Após 18 a 24 horas de revestimento celular, adicione os complexos lipídicos de siRNA às inserções de células O9-1 e incube por aproximadamente 34 a 48 horas.
Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, remova bem o meio da câmara C2C12 e lave as células uma vez com PBS. Depois de remover o PBS, comece a arranhar as células passando uma ponta de pipeta P10 estéril firmemente em uma única direção para abranger todo o comprimento ou largura da monocamada da célula. Uma vez que as células estão arranhadas, adicione rapidamente um mililitro de PBS.
Em seguida, ligue o computador e o microscópio. Coloque o slide da câmara no palco e gire o mostrador da objetiva para aumentar 5X. Abra o software de imagem.
Clique na guia da câmera e, em seguida, clique no botão Live para visualizar as células na guia AxioCam IC. Certifique-se de que o filtro de luz é puxado todo o caminho para fora para permitir que a luz passe para a câmera e tela do computador, mova manualmente ou gire o slide da câmara para posicionar a área da ferida no centro da imagem ao vivo na guia AxioCam IC. Para tirar imagens, clique em Ajustar para abrir uma nova guia ao lado da guia AxioCam IC que contém a imagem.
Para salvar essa imagem estática, clique no arquivo, selecione salvar como, selecione área de trabalho na barra à esquerda para salvar o arquivo na área de trabalho, digite o nome do arquivo na caixa de nome do arquivo e salve a figura no formato de arquivo czi. Para salvar a imagem como um tiff, clique em arquivo, selecione salvar como, digite o nome do arquivo na caixa Nome do arquivo. Clique no botão Salvar como tipo e selecione tiff no menu suspenso.
Reposicione manualmente a lâmina da câmara para tirar mais duas a três imagens em outros pontos da ferida no mesmo poço. Após a imagem, remova o PBS de cada poço e adicione um mililitro de meio C2C12. Monte o sistema de co-cultura de inserção de poços colocando manualmente as inserções contendo as células de O9-1 em cada poço do poço da câmara.
Empurre suavemente as inserções para baixo no poço, de modo que a parte inferior da inserção fique logo acima das células C2C12 subjacentes. Devolva as construções de inserção do poço à incubadora e permita que as células migrem por um total de nove a 12 horas. Para determinar o tempo de migração ideal, verifique as células em seis horas após a criação da ferida e, em seguida, a cada duas a três horas depois disso.
Termine o experimento quando as células em condições de controle cobrirem completamente a ferida. Inicie a terminação do ensaio de migração e insira bem a desconstrução do sistema removendo as inserções de células O9-1 após nove a 12 horas do período de migração. Aspirar cuidadosamente o meio C2C12.
Adicione 0,5 mililitros de PBS aos poços da câmara e tire as imagens finais das células após a migração. Aspirar cuidadosamente todos os PBS misturados com meio e remover as câmaras de plástico dos poços da câmara usando as instruções do kit. Deixando a lâmina subjacente contendo as células C2C12.
Para imunocoloração, incubar imediatamente a lâmina com aldeído paraforme a 4% por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o paraformaldeído e lave a lâmina com 0,1% de Triton X-100 contendo PBST por 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, despeje o PBST e lave a lâmina duas vezes com PBS por 10 minutos cada.
Em seguida, crie um limite hidrofóbico com uma caneta hidrofóbica ao redor da lâmina para evitar que as soluções se derramem da lâmina, impedindo a interrupção das células de aderência. Em seguida, adicione aproximadamente 0,5 mililitros de solução de bloqueio de 1% de BSA à lâmina dentro do limite hidrofóbico e incube a lâmina por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara de lâmina umidificada. No final da incubação, remova a solução de bloqueio e adicione o anticorpo de faloidina a esta lâmina dentro do limite hidrofóbico e incube a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, coloque o slide em um suporte de slide protegido da exposição à luz. Lave as células três vezes com PBS por 10 minutos cada à temperatura ambiente. Adicione o meio de montagem contendo DAPI, monte as lâminas com lâminas de tampa de vidro e capture as células usando um microscópio de fluorescência padrão.
No presente estudo, a adição de Wnt5a recombinante a poços de cocultura acelerou a migração mioblástica com recuperação completa de algumas áreas em nove horas. Os mioblastos migratórios nas três condições exibiram morfologia celular migratória normal, incluindo filópodedos e lamellipodos bem formados e salientes e polarização assimétrica das projeções citoesqueléticas de actina. O efeito parácrino do Wnt5a derivado de NCC na migração mioblástica foi estudado.
O tratamento com 50 siRNA nanomolares contra Wnt5a reduziu a expressão gênica de Wnt5a em 64% em comparação com o controle negativo. A migração de blastos de C2C12 milhas com redução significativa após o knockdown de Wnt5a em NCCs e a adição de Wnt5a recombinante exógeno resgataram esse déficit migratório e defeito morfológico nesses mioblastos. Para melhor compreensão dos mecanismos celulares receptores de sinal no modelo parácrino, o receptor ROR2 foi derrubado e a expressão gênica foi reduzida em 54%Knockdown de ROR2 em mioblastos reduz sua capacidade migratória, apesar da presença de psic.
O Wnt5a recombinante exógeno não conseguiu resgatar a migração de mioblastos após o knockdown do ROR2, sugerindo que a depleção do ROR2 interrompe a capacidade dos mioblastos de receber sinais Wnt5a. Células de cultura para arranhão de densidade adequada com ponta P10 apenas uma vez montam e desmontam o sistema de co-cultura com cuidado sem interromper a célula subjacente. Esta técnica foi usada como prova de conceito para estudar um eixo de sinalização molecular específico dentro da complexa via Wnt/PCP com relevância para a biologia da crista neural e do segundo campo cardíaco.
