Ce protocole décrit une méthode hautement reproductible pour évaluer fonctionnellement et moléculairement la signalisation Wnt paracrine non canonique dans toute population cellulaire d’intérêt. Les évaluations fonctionnelles et moléculaires sont effectuées dans la même population cellulaire et peuvent être appliquées à l’étude de n’importe quelle composante de la voie Wnt/PCP. Pour commencer, remettez en suspension la cellule C2C12 précédemment granulée dans 10 millilitres de milieu C2C12.
Pour diluer les cellules dans un rapport de 1:20, ajoutez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres contenant 9,5 millilitres de milieu C2C12 frais et mélangez doucement avec une pipette sérologique à l’aide d’une pipette P1000, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’un nouveau puits à quatre chambres et placez-le dans l’incubateur. Pour le placage des inserts de cellules O9-1, remettre en suspension la pastille de cellule O9-1 dans 10 millilitres de milieu de croissance O9-1. Et semblable à la dilution des cellules C2C12, diluez les cellules O9-1 dans un rapport de 1:20.
Ensuite, placez un seul insert perméable à l’intérieur de chaque puits d’un nouveau puits à quatre chambres rempli d’un millilitre de milieu de croissance O9-1. Ajouter 300 microlitres de la suspension cellulaire O9-1 diluée à chaque insert et s’assurer que l’insert est complètement immergé. Incuber ensuite le puits à 37 degrés Celsius.
Pour effectuer l’élimination du siRNA dans les cellules O9-1, diluer le siRNA et le réactif de transfection dans le milieu sérique réduit selon les recommandations du fabricant aux concentrations souhaitées. Mélanger délicatement le siRNA dilué et le réactif de transfection et incuber le mélange à température ambiante pendant sept minutes. Après 18 à 24 heures de placage cellulaire, ajouter les complexes lipidiques siRNA aux inserts cellulaires O9-1 et incuber pendant environ 34 à 48 heures.
Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, retirez bien le milieu de la chambre C2C12 et lavez les cellules une fois avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, commencez à gratter les cellules en passant fermement une pointe de pipette P10 stérile dans une seule direction pour couvrir toute la longueur ou la largeur de la monocouche cellulaire. Une fois les cellules rayées, ajoutez rapidement un millilitre de PBS.
Ensuite, allumez l’ordinateur et le microscope. Placez la glissière de la chambre sur la scène et faites pivoter le cadran de l’objectif à un grossissement de 5X. Ouvrez le logiciel d’imagerie.
Cliquez sur l’onglet de la caméra, puis sur le bouton En direct pour visualiser les cellules de l’onglet AxioCam IC. Assurez-vous que le filtre de lumière est complètement tiré pour permettre à la lumière de passer à l’écran de la caméra et de l’ordinateur, déplacez ou faites pivoter manuellement la glissière de la chambre pour positionner la zone enroulée au centre de l’image en direct sur l’onglet AxioCam IC. Pour prendre des images, cliquez sur Aligner pour ouvrir un nouvel onglet en regard de l’onglet AxioCam IC qui contient l’image.
Pour enregistrer cette image fixe, cliquez sur le fichier, sélectionnez Enregistrer sous, sélectionnez Bureau dans la barre de gauche pour enregistrer le fichier sur le bureau, entrez le nom du fichier dans la zone Nom de fichier et enregistrez la figure au format de fichier czi. Pour enregistrer l’image au format tiff, cliquez sur fichier, sélectionnez Enregistrer sous, entrez le nom du fichier dans la zone Nom de fichier. Cliquez sur le bouton Type de fichier et sélectionnez tiff dans le menu déroulant.
Repositionnez manuellement la lame de chambre pour prendre deux à trois images supplémentaires à d’autres points de la plaie dans le même puits. Après l’imagerie, retirez le PBS de chaque puits et ajoutez un millilitre de milieu C2C12. Assembler le système de coculture d’insertion de puits en plaçant manuellement les inserts contenant les cellules O9-1 dans chaque puits du puits de la chambre.
Poussez doucement les inserts vers le bas dans le puits, de sorte que le fond de l’insert se trouve juste au-dessus des cellules C2C12 sous-jacentes. Retournez les constructions d’insertion de puits dans l’incubateur et laissez les cellules migrer pendant un total de neuf à 12 heures. Pour déterminer le temps de migration optimal, vérifiez les cellules six heures après la création de la plaie, puis toutes les deux à trois heures par la suite.
Terminez l’expérience lorsque les cellules dans des conditions de contrôle couvrent complètement la plaie. Commencer la fin de l’essai de migration et la déconstruction du système d’insertion de puits en retirant les inserts de cellules O9-1 après neuf à 12 heures de la période de migration. Aspirer soigneusement le milieu C2C12.
Ajoutez 0,5 millilitre de PBS aux puits de la chambre et prenez des images finales des cellules après la migration. Aspirez soigneusement tout le PBS mélangé avec du milieu et retirez les chambres en plastique des puits de la chambre en utilisant les instructions de la trousse. Quitter la lame sous-jacente contenant les cellules C2C12.
Pour l’immunomarquage, incuber immédiatement la lame avec de l’aldéhyde paraforme à 4% pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le paraformaldéhyde et lavez la lame avec du Triton X-100 à 0,1% contenant du PBST pendant 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, versez PBST et lavez la lame deux fois avec PBS pendant 10 minutes chacune.
Ensuite, créez une limite hydrophobe avec un stylo hydrophobe autour de la lame pour empêcher les solutions de se répandre de la lame empêchant la perturbation des cellules d’adhérence. Ensuite, ajoutez environ 0,5 millilitre de solution bloquante à 1% BSA à la lame à l’intérieur de la limite hydrophobe et incuber la lame pendant une heure à température ambiante dans une chambre à lame humidifiée. À la fin de l’incubation, retirer la solution bloquante et ajouter l’anticorps phalloïdine à cette lame dans la limite hydrophobe, puis incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, placez la lame dans un support de diapositive protégé de l’exposition à la lumière. Laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune à température ambiante. Ajoutez un support de montage contenant du DAPI, montez les lames avec des lames de couvercle en verre et capturez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence standard.
Dans la présente étude, l’ajout de Wnt5a recombinant aux puits de co-culture a accéléré la migration des myoblastes avec une récupération complète de certaines zones en neuf heures. Dans les trois conditions, les myoblastes migrateurs présentaient une morphologie cellulaire migratoire normale, y compris des filopodies et des lamellipodes bien formés et saillants et une polarisation asymétrique des projections cytosquelettiques d’actine. L’effet paracrine de Wnt5a dérivé de NCC sur la migration des myoblastes a été étudié.
Le traitement avec 50 nanomolaires siRNA contre Wnt5a a réduit l’expression du gène Wnt5a de 64% par rapport au contrôle négatif. La migration des explosions de milles C2C12 avec une réduction significative après l’élimination de Wnt5a dans les CCN et l’ajout de Wnt5a recombinant exogène ont sauvé ce déficit migratoire et ce défaut morphologique dans ces myoblastes. Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires de réception du signal dans le modèle paracrine, le récepteur ROR2 a été renversé et l’expression génique a été réduite de 54%.
Le Wnt5a recombinant exogène n’a pas réussi à sauver la migration des myoblastes après l’élimination de ROR2, ce qui suggère que la déplétion de ROR2 perturbe la capacité des myoblastes à recevoir des signaux Wnt5a. Cellules de culture à densité adéquate rayer avec pointe P10 une seule fois assembler et démonter le système de co-culture avec soin sans perturber la cellule sous-jacente. Cette technique a été utilisée comme preuve de concept pour étudier un axe de signalisation moléculaire spécifique dans la voie complexe Wnt / PCP avec une pertinence pour la biologie des cellules de la crête neurale et du deuxième champ cardiaque.
