Este protocolo describe un método altamente reproducible para evaluar funcional y molecularmente la señalización paracrina no canónica de Wnt en cualquier población celular de interés. Las evaluaciones funcionales y moleculares se realizan en la misma población celular y se pueden aplicar para estudiar cualquier componente de la vía Wnt/PCP. Para comenzar, resuspenda la celda C2C12 previamente peletizada en 10 mililitros de medio C2C12.
Para diluir las células en una proporción de 1:20, agregue 0,5 mililitros de suspensión celular en un tubo de 15 mililitros que contenga 9,5 mililitros de medio C2C12 fresco y mezcle suavemente con una pipeta serológica con una pipeta P1000, agregue un mililitro de la suspensión celular diluida a cada pocillo de un nuevo pozo de cuatro cámaras y colóquelo en la incubadora. Para placar los insertos de células O9-1, resuspenda el pellet de celda O9-1 en 10 mililitros de medio de crecimiento O9-1. Y similar a la dilución celular C2C12, diluya las células O9-1 en una proporción de 1:20.
A continuación, coloque un solo inserto permeable dentro de cada pocillo de un nuevo pozo de cuatro cámaras lleno de un mililitro de medio de crecimiento O9-1. Agregue 300 microlitros de la suspensión de celda O9-1 diluida a cada inserto y asegúrese de que el inserto esté completamente sumergido. Luego incubar el pozo a 37 grados centígrados.
Para realizar la eliminación del ARNip en las células O9-1, diluya el ARNip y el reactivo de transfección en el medio sérico reducido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante a las concentraciones deseadas. Mezclar suavemente el siRNA diluido y el reactivo de transfección e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante siete minutos. Después de 18 a 24 horas de recubrimiento celular, agregue los complejos lipídicos de ARNip a los insertos de células O9-1 e incube durante aproximadamente 34 a 48 horas.
Cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80%, retire bien el medio de la cámara C2C12 y lave las células una vez con PBS. Después de retirar el PBS, comience a rascar las células pasando firmemente una punta de pipeta P10 estéril en una sola dirección para abarcar toda la longitud o anchura de la monocapa celular. Una vez que las células estén rayadas, agregue rápidamente un mililitro de PBS.
A continuación, encienda la computadora y el microscopio. Coloque la corredera de la cámara en el escenario y gire el dial del objetivo con un aumento de 5X. Abra el software de imágenes.
Haga clic en la pestaña cámara y, a continuación, haga clic en el botón Live para visualizar las celdas en la pestaña AxioCam IC. Asegúrese de que el filtro de luz esté completamente extendido para permitir que la luz pase a la cámara y a la pantalla de la computadora, mueva o gire manualmente la diapositiva de la cámara para colocar el área de la herida en el centro de la imagen en vivo en la pestaña AxioCam IC. Para tomar imágenes, haga clic en ajustar para abrir una nueva pestaña junto a la pestaña AxioCam IC que contiene la imagen.
Para guardar esta imagen fija, haga clic en el archivo, seleccione guardar como, seleccione escritorio en la barra de la izquierda para guardar el archivo en el escritorio, ingrese el nombre del archivo en el cuadro de nombre de archivo y guarde la figura en formato de archivo czi. Para guardar la imagen como un tiff, haga clic en archivo, seleccione guardar como, escriba el nombre del archivo en el cuadro nombre de archivo. Haga clic en el botón Guardar como tipo y seleccione tiff en el menú desplegable.
Cambie manualmente la diapositiva de la cámara para tomar dos o tres imágenes más en otros puntos de la herida en el mismo pozo. Después de la imagen, retire el PBS de cada pocillo y agregue un mililitro de C2C12 medio. Ensamble el sistema de cocultivo de insertos de pozo colocando manualmente los insertos que contienen las células O9-1 en cada pocillo del pozo de la cámara.
Empuje suavemente los insertos hacia abajo en el pozo, de modo que la parte inferior del inserto se encuentre justo encima de las células C2C12 subyacentes. Devuelva las construcciones del inserto del pozo a la incubadora y permita que las células migren durante un total de nueve a 12 horas. Para determinar el tiempo óptimo de migración, verifique las células seis horas después de la creación de la herida, luego cada dos o tres horas después de eso.
Termine el experimento cuando las células en condiciones de control cubran completamente la herida. Comience la terminación del ensayo de migración y la deconstrucción del sistema de inserción de pozo eliminando los insertos de células O9-1 después de nueve a 12 horas del período de migración. Aspirar cuidadosamente el medio C2C12.
Agregue 0.5 mililitros de PBS a los pocillos de la cámara y tome imágenes finales de las células después de la migración. Aspire cuidadosamente todo el PBS mezclado con medio y retire las cámaras de plástico de los pozos de la cámara siguiendo las instrucciones del kit. Dejando la diapositiva subyacente que contiene las celdas C2C12.
Para la inmunotinción, incubar inmediatamente el portaobjetos con aldehído paraformado al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego retire el paraformaldehído y lave el portaobjetos con Triton X-100 al 0,1% que contiene PBST durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, vierta PBST y lave el portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos cada una.
Luego cree un límite hidrofóbico con una pluma hidrófoba alrededor del portaobjetos para evitar que las soluciones se derramen del portaobjetos evitando la interrupción de las células de adherencia. A continuación, agregue aproximadamente 0,5 mililitros de solución de bloqueo BSA al 1% al portaobjetos dentro del límite hidrofóbico e incube el portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente en una cámara de portaobjetos humidificada. Al final de la incubación, retire la solución de bloqueo y agregue el anticuerpo faloidina a esta diapositiva dentro del límite hidrofóbico, e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, coloque la diapositiva en un portaportaobjetos protegido de la exposición a la luz. Lave las celdas tres veces con PBS durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente. Agregue un medio de montaje que contenga DAPI, monte los portaobjetos con cubreobjetos de vidrio y capture las células con un microscopio de fluorescencia estándar.
En el presente estudio, la adición de Wnt5a recombinante a los pozos de cocultivo aceleró la migración de mioblastos con la recuperación completa de algunas áreas en nueve horas. Los mioblastos migratorios en las tres condiciones exhibieron una morfología celular migratoria normal, incluyendo filopodios y lamellipodia bien formados y sobresalientes y polarización asimétrica de las proyecciones citoesqueléticas de actina. Se estudió el efecto paracrino de Wnt5a derivado de NCC sobre la migración de mioblastos.
El tratamiento con 50 siRNA nanomolares contra Wnt5a redujo la expresión del gen Wnt5a en un 64% en comparación con el control negativo. La migración de explosiones de C2C12 millas con una reducción significativa después del derribo de Wnt5a en NCC y la adición de Wnt5a recombinante exógeno rescató este déficit migratorio y defecto morfológico en estos mioblastos. Para comprender mejor los mecanismos de las células receptoras de señales en el modelo paracrino, el receptor ROR2 fue derribado y la expresión génica se redujo en un 54%La caída de ROR2 en mioblastos reduce su capacidad migratoria a pesar de la presencia de NCC.
El Wnt5a recombinante exógeno no pudo rescatar la migración de mioblastos después del derribo de ROR2, lo que sugiere que el agotamiento de ROR2 interrumpe la capacidad de los mioblastos para recibir señales de Wnt5a. Cultive células a una densidad adecuada rasguño con punta P10 solo una vez ensamble y desensamble el sistema de cocultivo con cuidado sin interrumpir la célula subyacente. Esta técnica se utilizó como prueba de concepto para estudiar un eje de señalización molecular específico dentro de la compleja vía Wnt/PCP con relevancia para la biología de las células de la cresta neural y el segundo campo cardíaco.
