Unser neues Protokoll hilft bei der Unterscheidung und Quantifizierung von drei Status von Röhrenringen, wie z. B. stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freie Tubuli in tierischen Geweben. Diese Technik besteht aus einfachen Schritten und kann die strukturelle Stabilität von Schläuchen bewerten, die durch Quantifizierung von Schläuchen nach translationaler Modifikation nicht nachgewiesen werden kann. Diese Methode ist essentiell für die Erforschung und Entwicklung von therapeutischen Wegen für Krankheiten, bei denen die Stabilität der Mikrotubuli entscheidend ist, wie z. B. Alzheimer und Krebs.
Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie die Laborkleidung für die Gewebedissektion vorbereiten. Füllen Sie eine Schachtel mit Crushed Ice und stellen Sie zwei Petrischalen darauf. Füllen Sie eine Schale mit eiskalter Phosphatpufferlösung oder PBS für das vorübergehende Waschen und Aufbewahren von präpariertem Gewebe.
Mit PBS angefeuchtetes Filterpapier auf die zweite Schale legen. Als nächstes wiegen Sie die mit PBS gefüllten 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen für die Lagerung von präpariertem Gewebe. Nachdem Sie das Gewebe aus einer euthanasierten Maus entnommen haben, übertragen Sie es in die Röhrchen und wiegen Sie jedes Mikroröhrchen erneut.
Bringen Sie das Gewebe in einen Glashomogenisator mit eiskaltem Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer oder MSB+Medium und homogenisieren Sie das Gewebe sofort mit einem gekühlten Homogenisator. Nun wird das Gewebehomogenat mit einer Pasteurpipette in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen überführt und bei 2.400 g drei Minuten bei zwei Grad Celsius zentrifugiert. Füllen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, um die Ablagerungen zu entfernen.
Den Überstand oder die S1-Fraktion in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen vortexen. Sofort 200 Mikroliter der S1-Fraktion in ein Zentrifugationsmikroröhrchen pipettieren und bei 100.000 G mit einem TLA-55-Rotor 20 Minuten lang bei zwei Grad Celsius zentrifugieren. Nach der zweiten Zentrifugation wird der S2-Überstand vom P2-Niederschlag getrennt.
Die gesamte Menge der S2-Fraktion wird sofort in ein Zentrifugationsmikroröhrchen überführt und mit einem TLA-120.2-Rotor 60 Minuten lang bei zwei Grad Celsius bei 500.000 g geschleudert. Nach der dritten Zentrifugation wird der S3-Überstand vom P3-Niederschlag getrennt. Lösen Sie die gesamte S3-Fraktion in 200 Mikrolitern 2X-Natriumdodecylsulfat oder SDS-Probenpuffer auf.
Mischen Sie die verbleibenden S1-Fraktionen mit einem gleichen Volumen von 2X SDS-Probenpuffer, um sie als Standardkurve für das Western Blot zu verwenden. Als nächstes werden 400 Mikroliter SDS-Probenpuffer in die P2- und P3-Fraktionsröhrchen gegeben. Beschallen Sie dann die Lösung kurz, um den Niederschlag aufzulösen, bevor Sie die Proben in neue 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen umfüllen und in die Kühlbox legen.
Kochen Sie alle Proben drei Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Mikrotubuli in der P2-Fraktion machten 34,86 % des gesamten Alpha-Tubulins in einem Mäusegehirn aus, während die Mikrotubuli in der P3- und S3-Fraktion 56,13 % bzw. 9,01 % ausmachten. Der prozentuale Anteil von Beta-3-Tubulin in den Fraktionen P2, P3 und S3 unterschied sich nicht signifikant von dem von Alpha-Tubulin.
Die S2-Fraktion zeigte eine begrenzte Passage von Tubulin durch eine 300-Kilodalton-Ultrafiltrations-Spin-Säule, während die S3-Fraktion eine vollständige Passage von Tubulin-Komplexen ermöglichte. Die chromatographische Trennung führte zu einer 100-Kilodalton-Elution von S3-Tubulin. In jeder Fraktion wurden gleiche Anteile an Alpha- und Beta-Tubulin gewonnen.
P2-Fraktionen waren signifikant mit acetyliertem Alpha-Tubulin angereichert, während tyrosiniertes Alpha-Tubulin in der P3-Fraktion dominierte. Das Einfrieren des Gehirns vor der Homogenisierung führte zu einer verminderten Alpha-Tubulin-Konzentration in den P2-Fraktionen. Alpha-Tubulin stieg jedoch in der P3-Fraktion an.
Das Einfrieren verringerte auch die Acetylierungswerte und erhöhte die Tyrosinierungswerte von Alpha-Tubulin in der P2-Fraktion. Die Behandlung mit Nocodazol verringerte das Alpha-Tubulin in der P2-Fraktion. Im Gegensatz zum Einfrieren hatte Nocodazol keinen Einfluss auf die posttranslationalen P2-Tubulin-Modifikationen.
Das Hirngewebe wies eine signifikant höhere Konzentration von P2-Tubulinen auf, während P3-Tubuline in proliferativem Gewebe konzentriert waren. Western Blotting zeigte, dass das speziell im Nervensystem vorkommende P2-Tubulin aus stabilen Mikrotubuli und P3-Tubulin aus labilen Mikrotubuli stammt. Die Stabilität der Mikrotubuli ist hochdynamisch.
Es ist wichtig, dieses Protokoll schnell und ohne Unterbrechungen in der Umgebung mit kalten Temperaturen abzuschließen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Gewebe und Fraktionen nicht eingefroren wurden, bis sie im SDS-Probenpuffer aufgelöst wurden. Es wird erwartet, dass die Kombination der Immunpräsentation mit jeder Fraktion mit der Proteomik Faktoren identifiziert, die an der Dynamik der Mikrotubuli beteiligt sind.
Mit dieser Methode konnten wir zeigen, wie normales Tau auf Mikrotubuli existiert. Es kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie es in gealterten Gehirnen abnormal wird, um neue medikamentöse Ziele für Demenz zu identifizieren.
