Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von mehreren hundert multizellulären tumorösen Sphäroiden in jeder Vertiefung einer Multi-Well-Platte, die für die automatisierte Mikroskopie geeignet ist. Das produzierte Sphäroid kann in verschiedene Größenklassen eingeteilt werden, und subzelluläre Informationen können aus jeder Zelle extrahiert werden. Die Technik produziert ausreichend Seren, die in direkten Screening- und RNA-Interferenzstudien verwendet werden können.
Verdünnen Sie ECM-Kellermaterial in kaltem phenolrotem serumfreiem Medium mit vorgekühlten Spitzen, die bei minus 20 Grad Celsius gehalten werden. Ich setze 15 Mikroliter des ECM-Kellermaterials und der mittleren Lösung in eine 96-Well-Bildplatte. Zentrieren Sie die Platte für 20 Minuten bei 91 mal G bei vier Grad Celsius.
Inkubieren Sie die Platte nicht länger als 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie den Zellen Trips und EDTA hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius am Ende der Inkubation, wir suspendieren die Zellen in einem vollständigen Medium, das 10% FBS enthält.
Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in eine Hämozytometer-Zählkammer. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in vier Quadranten der Kammer. Centra betrachtet die Zellen bei Raumtemperatur vier Minuten lang mit 135 mal G.
Sobald diese Zellen pelletiert werden, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem phenolrotfreien vollständigen Medium, um eine Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten. Verdünnen Sie die Zellen in einem phenolrotfreien vollständigen Medium. Sehen Sie die Zellen tropfenweise in einer kreisförmigen Bewegung in einem Gesamtvolumen von 35 Mikrolitern pro Well.
Inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Bei 1,2 Mikrolitern ECM-Kellermaterial zu 23,8 Mikrolitern phenolrotfreiem Vollmedium pro Welle, was zu einem Endvolumen von 60 Mikrolitern pro Vertiefung führt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch 100 Mikroliter frisches phenolrotfreies Vollmedium. Setzen Sie die 96-Well-Platte, die Sphäroide enthält, in ein konfokales High-Content-Screening-Mikroskop ein. Wählen Sie die geeigneten Laser aus, um die verwendeten Böden anzuregen.
Erfassen Sie die Kanäle nacheinander, um Übersprechen zu vermeiden, und stellen Sie die Sphäroide mit geeigneten Objektiven dar. Um die Morphologie von Sphäroiden zu analysieren, segmentieren Sie die Sphäroide basierend auf dem fluoreszierend konjugierten FLoid und der Färbung. Segmentieren Sie die Kerne basierend auf den Sechskantfärbungen drei, drei, drei, vier, zwei.
Segmentieren Sie das Zytoplasma jeder Zelle durch den Restsechskant drei, drei, vier, zwei, Fleck, der im Zellzytoplasma vorhanden ist. Berechnen Sie verschiedene morphologische Eigenschaften der Sphäroide, einschließlich Volumen, Oberfläche, Sphärizität und die Anzahl der Kerne pro seinen Sphäroiden. Ross hat Bilder weiter, um Sphäroide zu entfernen, die kleiner als 75 Kubikmikrometer und größer als 900.000 Kubikmikrometer sind.
Um eine einzelne Zelle innerhalb von Sphäroiden zu analysieren, segmentieren Sie die Sphäroide basierend auf der fluoreszierend konjugierten Sphäroidfärbung. Segmentieren Sie die Kerne basierend auf den Sechskantfärbungen drei, drei, drei, vier, zwei. Segmentieren Sie das Zytoplasma jeder Zelle durch den verbleibenden Sechskant drei, drei, drei, vier, zwei Färbungen, die im Zellzytoplasma vorhanden sind.
Segmentieren Sie die Lysosomen anhand der sekundären Antikörperfärbung. Berechnen Sie verschiedene morphologische Eigenschaften der Zellen in jedem Sphäroid, einschließlich der Anzahl der Lysosomen pro Zelle, des Zellvolumens und der Zelloberfläche. Die Abbildung zeigt einen Überblick über drei verschiedene Arten von Sphäroiden, einschließlich Bildern in verschiedenen konfokalen Ebenen.
Eine volumetrische Ansicht der gesamten Sphäroide wird ebenfalls gezeigt. Die Abbildung zeigt den pH-Segmentierungsprozess, Panel A zeigt die gesamten Sphäroide in einer volumetrischen Ansicht. Panel B zeigt die eingestellte Segmentierung des Zytoplasmas, der Kerne und der Lysosomen innerhalb aller Zellen eines einzelnen Sphäroides.
Das Zytoplasma und die Kerne werden basierend auf der Hexadezimal-Drei-, Drei-, Drei-, Vier-, Zwei-Färbung segmentiert. Und Lysosomen werden basierend auf der Anti-Labor-Eins-Antikörperfärbung segmentiert. Bedienfelder C zeigen die gleichen Segmente wie Panel B, jedoch in einer Ansicht mit drei Ebenen.
Verschiedene morphologische Messungen auf der Ebene der Sphäroide können durchgeführt werden. Diese Messungen umfassen die Berechnung der Anzahl der Kerne pro Sphäroide sowie dieser Felizität, des Volumens und der Oberfläche des pH-Wertes. Das typische Volumen jeder Zelle in den drei Sphäroidtypen.
Sowie die Anzahl der Lysosomen pro Zelle sind in dieser Abbildung dargestellt. Die Optimierung der anfänglichen Zellsitzdichte zu Beginn der SP-Generierung ist ein kritischer Schritt. Die Abbildung zeigt, dass das Hinzufügen von zu vielen Zellen immer noch die Bildung von Sphäroiden ermöglicht.
Dies kann jedoch zur Fusion von Sphäroiden führen. Auf diese Weise produzierende Sphäroide können einer transkriptomischen und proteomischen Analyse unterzogen werden. Diese Technik wird verwendet, um die Aufnahme der Wirkstoffabgabe solcher Nanopartikel quantitativ zu analysieren und ihre Toxizität für einzelne Zellen in den Sphäroiden zu bewerten.
