Diese Methode erzeugt einen Cardiolipin-Fingerabdruck von Leukozyten mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie und ermöglicht die Messung des Verhältnisses zwischen Monolysocardiolipin und Cardiolipin für eine schnelle Diagnose des Barth-Syndroms. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der Nachweis diagnostischer Lipidspezies durch eine einzige Runde Massenspektrometrie unmittelbar nach der Isolierung von Leukozyten aus einem Milliliter Blut. Diese und die Augensensitivität und Spezifität machen diesen Assay zu einem geeigneten diagnostischen Test, der in die Routinearbeit klinischer Labore integriert werden kann, um auf das Barth-Syndrom zu screenen.
Beginnen Sie, indem Sie Blutproben für 10 Minuten auf einen Orbitalschüttler legen. Als nächstes fügen Sie zu 0,9 Millilitern Vollblut in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen 0,1 Milliliter 20% Dextran hinzu. Pipettieren und dispergieren Sie nun die Suspension sanft 20 Mal, wobei Luftblasen vermieden werden, und lassen Sie RBCs bei Raumtemperatur etwa eine Stunde lang sedimentieren.
Mit einer Spritze den gelben Überstand sammeln, in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen und dann bei Raumtemperatur 15 Minuten lang bei 400 mal G zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet, das hauptsächlich Leukozyten und Rest-RBCs enthält, in 0,6 Millilitern eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser resuspendiert. Nach etwa 15 Sekunden fügen Sie 0,2 Milliliter 0,6 molares Kaliumchlorid in die Zellsuspension ein, um die korrekte Osmolarität wiederherzustellen.
Der kurze osmotische Schock wird RBC lysieren und Leukozyten intakt lassen. Stellen Sie dann das endgültige Volumen mit PBS in Einzelstärke auf 2,5 Milliliter ein. Als nächstes zentrifugieren Sie die Suspension bei 400 mal G für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Anschließend wird der Überstand entsorgt und das Leukozytenpellet mit 2,5 Millilitern PBS in Einzelstärke erneut gewaschen. Wiederholen Sie die Zentrifuge und entsorgen Sie den Überstand wie zuvor beschrieben und suspendieren Sie das Pellet, das Leukozyten enthält, in 200 Mikrolitern sterilisiertem doppelt destilliertem Wasser. Die Suspension bei minus 80 Grad Celsius einfrieren oder direkt eine Lipidextraktion durchführen.
Beginnen Sie die Extraktion, indem Sie 20 Mikroliter Leukozytenssuspension auf ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen und 30 Sekunden lang bei 16.000 mal G drehen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 10 Mikroliter Chloroform zum verbleibenden Pellet hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um die Lipidextraktion zu fördern. Fügen Sie nun 10 Mikroliter 9-Aminoacridin-Matrixlösung in Chloroform in das Pellet ein.
Pipettieren und wiederholt dispergieren, um zu mischen. Drehen Sie die Lösung, die Lipide und Chloroform und 9-Aminoacridin-Matrixlösung enthält, bei 16.000 mal G für 30 Sekunden. Zum Schluss lagern Sie den Überstand als Tröpfchen von 0,35 Mikrolitern auf dem zu analysierenden MALDI-Target ab und lassen die Tröpfchen mindestens 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen.
Für die Lipidanalyse werden Massenspektren von Proben in dreifacher Ausfertigung auf einem MALDI-TOF-Massenspektrometer erfasst. Stellen Sie nach der Kalibrierung mit Lipidstandards die Analysen in den negativen Ionenmodus und optimieren Sie den Detektionsmassen-Ladungs-Verhältnisbereich von 200 Thomson bis 2.000 Thomson für die Analyse kleiner Moleküle. Halten Sie die Laserfluenz 5% über dem Schwellenwert, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu haben.
Wenden Sie für jedes Massenspektrum durchschnittlich 2.000 einzelne Laserschüsse an. Erfassen Sie das Spektrum im Reflektormodus mit verzögerter gepulster Extraktion. Wenden Sie die Gated Matrix-Suspension auf 400 Thomson an, um eine Sättigung des Detektors zu verhindern.
Die Abbildung zeigt, dass die Defekte im TAFAZZIN-Gen typischerweise ein für das Barth-Syndrom spezifisches Lipidprofil bestimmen, das durch das Auftreten von Monolysocardiolipin und unreifen Cardiolipin-Formen zusammen mit der Reduktion reifer Cardiolipin-Formen im Cardiolipin-Fingerabdruck angezeigt wird. Darüber hinaus zeigt die Abbildung auch, dass MALDI-TOF/MS-Analysen von Leukozyten von Kontrollpersonen typischerweise nur zwei Arten von reifem Cardiolipin zeigen. Die Abbildung zeigt, dass Monolysocardiolipin plus unreifes Cardiolipin im reifen Cardiolipin-Verhältnis für Barth-Syndrom-Patienten höher war als für gesunde Probanden und Patienten mit Herzinsuffizienz.
Hier sind die Kontrollgruppen und die Patienten mit dem Barth-Syndrom durch mehr als eine Größenordnung getrennt, was zeigt, dass diese Methode eine starke diagnostische Fähigkeit für das Barth-Syndrom hat. Um ein gutes Assay-Ergebnis zu gewährleisten, ist es wichtig, alle Protokollschritte von der Leukozytenisolierung bis zur Berechnung des Monolysocardiolipin-zu-Cardiolipin-Verhältnisses sorgfältig zu befolgen. Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist nützlich, um Lipidprofile kleiner Mengen verschiedener biologischer Proben zu erhalten, um Lipidbiomarker oder pathologische Veränderungen zu identifizieren.
