Die Methode visualisiert und quantifiziert die Fähigkeit von Krebszellen, sich zu delaminieren und einzudringen, wodurch ihre metastatische Aggressivität vor der Wirkungsbildung oder Metastasierung beurteilt werden kann. Dass das Scoring auf dem Delaminationsprozess als Voraussetzung für die Metastasenbildung basiert und dadurch relativ schnell, einfach und kostengünstig Informationen über die metastasierende Aggressivität der Zellen erhält. Üben Sie zuerst die verschiedenen einzelnen Schritte, bevor Sie mit dem eigentlichen Experiment beginnen.
Der CAM-Delam-Assay umfasst mehrere technische Schritte, die schwer schriftlich zu erklären und durch visuelle Demonstration viel einfacher zu schätzen und zu erlernen sind. Legen Sie zunächst die gewünschte Anzahl von Eiern in Eierschalen und bebrüten Sie die Kükeneier horizontal in einem Eierinkubator. Dann sterilisieren Sie 30 Wiegeboote und 30 kleine Kunststoffboxen mit transparenten Kappen, indem Sie 70% Ethanol sprühen.
Als nächstes trocknen Sie die Wiegeboote und Kisten über Nacht in einer Laminarhaube und lagern Sie sie in einer geschlossenen Kunststoffbox, bis sie am dritten Inkubationstag weiter verwendet werden. Sterilisieren Sie zwei Liter destilliertes oder entionisiertes Wasser pro 30 bebrütete Eier, zwei Paar Scheren und drei Paar Pinzetten. Geben Sie zunächst etwa 50 Milliliter sterilisiertes Wasser in die sterilisierten Kunststoffboxen und schließen Sie die Deckel.
Am dritten Inkubationstag die Eierschale mit dem scharfen Teil der Schere knacken und eine gerade Öffnung in die Schale schneiden. Nachdem Sie die Eierschale manuell über einem Wiegeboot geöffnet haben, sammeln Sie das Eiweiß, das Eigelb und es wird ein gesunder Embryo im Wiegeboot befestigt. Suchen Sie dann nach einem intakten Embryo mit einem schlagenden Herzen, intaktem Eigelb und entwickelten Blutgefäßen für das Experiment.
Als nächstes bringen Sie das Wiegeboot vorsichtig in eine interne befeuchtete Kammer und inkubieren Sie die interne befeuchtete Kammer im Eierinkubator. Zur Herstellung von Silikonringen schneiden Sie ein Silikonrohr mit einem Innen- und Außendurchmesser von vier Millimetern bzw. fünf Millimetern in etwa einem Millimeter Dicke, vorzugsweise mit einem Papierschneider. Anschließend die Silikonringe auf kleine Glasflaschen umfüllen.
Decken Sie sie mit Metallfolie ab und sterilisieren Sie sie mit einem Autoklaven oder ähnlichem. Lagern Sie die sterilen Silikonringe bei Raumtemperatur. Kultivieren Sie die interessierenden Krebszelllinien im jeweiligen Kulturmedium in Zellkultur.
Dann bereiten Sie einen Milliliter Kollagen-RPMI-Mischung zu und halten Sie ihn auf Eis. Als nächstes versuchen Sie, die Krebszellen zu testen, um die Zellen zu isolieren, indem Sie zuerst das Zellkulturmedium entfernen und waschen. Dann drei Milliliter Trypsinlösung pro Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern hinzufügen und zwei bis drei Minuten in einem Zellkulturinkubator inkubieren, bis sich die Zellen lösen.
Sehen Sie sich mit einem invertierten Tischmikroskop die abgetrennten Zellen an. Inaktivieren Sie dann Trypsin, indem Sie jeder Zellkulturschale fünf Milliliter vollständiges RPMI-Medium hinzufügen und die Zellsuspension aus allen Zellkulturschalen in einem 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Um die Krebszellen zu zählen, fügen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu 10 Mikrolitern 0,4% Trypan-Blaufleck hinzu.
Nachdem Sie die Probe durch einige Male auf und ab pipettiert haben, laden Sie 10 Mikroliter der Zellmischung pro Kammer in den Probenobjektträger im Zellzähler. Als nächstes zentrifugieren Sie die richtige Volumenzellkultursuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen bei 500 mal G für fünf Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, mischen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter des Kollagen-RPMI-Mixes.
Sobald die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette gemischt sind, halten Sie die vorbereitete Zellsuspension auf Eis. Nehmen Sie am 10. Inkubationstag die inneren befeuchteten Kammern mit den bebrüteten schalenlosen Eiern aus dem Inkubator. Nachdem Sie die interne befeuchtete Kammer geöffnet haben, legen Sie bis zu sechs Silikonringe mit sterilisierten Pinzetten auf das CAM.
Sobald die Krebszellsuspension durch Pipettieren gemischt wurde, um eine gleichmäßige Verteilung der Krebszellen zu erhalten, fügen Sie 20 Mikroliter der vorbereiteten Krebszellsuspension in einen Silikonring hinzu. Nachdem Sie die innere befeuchtete Kammer geschlossen haben, legen Sie sie in den Eierinkubator. Nehmen Sie nach 14 Stunden, 1,5 Tagen, 2,5 Tagen und 3,5 Tagen Inkubation etwa sieben innere befeuchtete Kammern heraus, während Sie ihre Deckel nacheinander öffnen.
Sezieren Sie mit einer Schere die kultivierten Krebszellen, die am CAM befestigt sind, indem Sie außerhalb des Silikonrings schneiden. Dann sofort die isolierte CAM-Delam-Probe mit einer Pinzette auf 4%Paraformaldehyd in 0,1 molaren Phosphatpuffer in einer Petrischale zur Fixierung des Gewebes überführen und eine Stunde lang auf Eis oder bei vier Grad Celsius aufbewahren. Als nächstes entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung und fügen den CAM-Delam-Proben 30%ige Saccharose in 0,1 molaren Phosphatpuffer hinzu und gleichen sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius aus.
Entfernen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig den Silikonring mit einer Pinzette. Als nächstes schneiden Sie die CAM-Delam-Probe in eine rechteckige Form mit den Krebszellen in der Mitte mit einer Schere. Übertragen Sie dann die CAM-Delam-Proben auf gefrorenes Schnittmedium in einer Petrischale, um überschüssige Saccharose zu entfernen, und dann auf das Einbetten von Formen in gefrorenes Schnittmedium mit einer Pinzette.
Positionieren Sie die CAM-Delam-Probe in einer vertikalen Reaktion in den Einbettungsformen mit einem beliebigen nadelartigen Instrument in einer U-Form und lagern Sie die CAM-Delam-Proben bei 80 Grad Celsius. Dann schneiden Sie die gefrorenen CAM-Delam-Proben mit 10 Mikrometern auf fünf bis sechs aufeinanderfolgenden Objektträgern mittels Kryosektion. Machen Sie zuerst eine Linie mit einem hydrophoben Marker auf den Dias an der Stelle, an der die Abschnitte enden, und lassen Sie sie einige Minuten trocknen.
Legen Sie die Objektträger dann in eine befeuchtete Kammer und bedecken Sie die Abschnitte mit ca. 200 bis 500 Mikrolitern Blockierlösung und inkubieren Sie für 15 bis 30 Minuten. Nach dem Abgießen der Blockierlösung durch 100 bis 150 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse, der in der blockierenden Lösung verdünnt ist, ersetzen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Ebenso werden die Objektträger nach dem Abgießen der primären Antikörperlösung auf die Glasküvetten übertragen und mindestens dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST gewaschen.
Als nächstes entfernen Sie überschüssiges TBST aus dem Objektträger und aus dem hydrophoben Barrierebereich mit einem weichen Papiertaschentuch und bedecken Sie den Objektträger mit 100 bis 150 Mikrolitern eines geeigneten sekundären fluoreszierenden Antikörpers, der in blockierender Lösung in Kombination mit DAPI verdünnt ist. Inkubieren Sie die Rutsche im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nachdem Sie die sekundäre Antikörperlösung abgegossen haben, geben Sie die Objektträger in die Glasküvetten und waschen Sie sie mindestens dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST.
Entfernen Sie dann überschüssige TBST aus dem Objektträger und aus dem hydrophoben Barrierebereich mit einem weichen Papiertuch. Als nächstes montieren Sie die Dias, indem Sie ein bis zwei Tropfen fluoreszierendes Montagemedium auf den Objektträger geben und vorsichtig einen Glasabdeckungsschlupf platzieren, während Sie Luftblasen vermeiden. Fotografieren Sie die Abschnitte mit einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, vorzugsweise bei 10-facher Vergrößerung, und analysieren Sie die Abschnitte mit den folgenden CAM-Delam-Bewertungskategorien, wie im Manuskript beschrieben.
Die Verwendung von internen befeuchteten Kammern verbesserte die Überlebensrate der Kükenembryonen signifikant von weniger als 50% bis 90% am Inkubationstag 10 und von etwa 15% bis zu 80% am Inkubationstag 13. Die Ergebnisse zeigen, dass die Fähigkeit von Krebszellen, Basallamina abzubauen und in das Mesenchym einzudringen, in vier Kategorien eingeteilt werden kann, darunter intakte Basallamina ohne sichtbare Veränderungen, veränderte, aber unbeschädigte Basallamina, beschädigte Basallamina ohne Zellinvasion und beschädigte Basallamina mit Zellinvasion. Die Antikörperfärbung gegen den von Willebrand-Faktor zeigt, dass das CAM auch mit einer Zunahme der Blutgefäßbildung verdickt wurde, wenn Krebszellen eine veränderte oder beschädigte Basallamina verursachten.
Keiner dieser beiden Phänotypen wurde jedoch beobachtet, wenn das CAM intakt war. Die PC-3U-Zellen induzierten beschädigtes Laminin nach 1,5 Tagen mit klarer Invasion nach 2,5 Tagen. Im Gegensatz dazu induzierten U251-Zellen nach 1,5 bis 3,5 Tagen nur geringfügige Veränderungen von Laminin, verursachten aber nie sichtbare Schäden an Laminin.
Nach der Behandlung mit Kobaltchlorid erlangten U251-nicht-metastasierende Krebszellen die Fähigkeit, Delamination und invasive Zellen zu induzieren, die in Kombination mit dem MMP-Inhibitor GM6001 unterdrückt wurden. Das CAM beim Aussäen der Krebszellen nicht mit der Pipettenspitze zu beschädigen, da eine solche Schädigung der Membran die Auslesungen des Assays zerstört. Eine zukünftige Möglichkeit besteht darin, die CAM-Delam-Methode zu optimieren, um metastasierende Eigenschaften in klinischen Tumorproben zu bestimmen, die in Zukunft das heute verwendete Tumorknoten-Metastasen-Staging ergänzen könnten.
