Wir haben die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion entwickelt. Die Pickering-Emulsion verbesserte die zelluläre Affinität zu Antigenproteinzellen und induzierte eine effiziente Internalisierung von Antigenen. Die nanopartikelstabilisierten Pickering-Emulsionen waren einfach herzustellen und liefern Antigene effizient.
Zusätzlich wurde eine Methode verwendet, um die Affinität der Emulsion zur Zelle zu überwachen und die Internalisierung zu erarbeiten. Dieses Protokoll liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Formulierungen mit hoher Zelleffizienz und effizienter Antigeninternalisierung, die eine Plattform für die Entwicklung effizienter Impfstoffe bieten. Zu Beginn fügen Sie 100 Milligramm Polymilch-Co-Glykolsäure zu 10 Milliliter Aceton-Ethanol-Mischung in einem Verhältnis von vier zu eins hinzu, um als Ölphase zu dienen.
20 Milliliter PVA-wässrige Lösung unter den Abzug geben und bei 400 Umdrehungen pro Minute magnetisch rühren. Fünf Milliliter der Ölphase tropfenweise mit einer Spritzenpumpe in die PVA-Lösung geben. Dann rühren Sie die Mischung im Abzug um, bis die organischen Lösungsmittel vollständig verdampft sind.
Nach der Verflüchtigung organischer Lösungsmittel zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 G.Waschen Sie drei oder mehrmals, bis das endgültige Waschwasser klar und transparent ist. Suspendieren Sie die gewaschenen PLGA-Nanopartikel in zwei Milliliter entionisiertem Wasser und frieren Sie die Mischung bei 80 Grad Celsius für 24 Stunden ein. Um die Größe und das Zetapotenzial von PLGA-Nanopartikeln zu charakterisieren, fügen Sie 10 Mikroliter PLGA-Nanopartikel in einen Milliliter entionisiertes Wasser hinzu, um eine Verdünnungslösung zu erhalten, und übertragen Sie die Verdünnungslösung in eine DTS1070-Zelle.
Schalten Sie den Computer und den dynamischen Lichtstreuanalysator ein. Setzen Sie dann die DTS1070-Zelle in das DLS-System ein. Klicken Sie auf die Zetasizer-Software und erstellen Sie eine neue Messdatei, um das Bestimmungsverfahren einzurichten.
Starten Sie dann das Bestimmungsverfahren, um die Partikelgröße und Zetapotentialverteilung zu erhalten. Um PLGA-Nanopartikel stabilisierte Pickering-Emulsion oder PNPE herzustellen, fügen Sie gefriergetrocknete PLGA-Nanopartikel zu entionisiertem Wasser in einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter hinzu und fügen Sie dann Squalan als Ölphase hinzu. Bereiten Sie PNPE über eine einstufige Beschallung für fünf Minuten bei 100 Watt in einem Wasserbadsonikator vor.
Verdünnen Sie 20 Mikroliter PNPE und einen Milliliter entionisiertes Wasser. Lassen Sie 20 Mikroliter der Emulsion auf den Objektträger fallen. Beobachten Sie die Morphologie und Homogenität der Emulsion mit optischer Mikroskopie bei 40-facher Vergrößerung und erhalten Sie Fotos.
Schalten Sie den Spin Coater ein, indem Sie den Netzschalter drücken. Drücken Sie die Steuertaste und stellen Sie die Beschichtungszeit und -geschwindigkeit ein. Verbinden Sie das Stickstoffrohr mit dem Schleuderbeschichter und stellen Sie die Fraktionierung der Gasflasche auf 0,4 Kilopascal ein.
Legen Sie den sauberen Chip auf den Saugnapf des Schleuderbeschichters. Fügen Sie 100 Mikroliter Poly-L-Lysin tropfenweise in die Mitte des Siliziumdioxidsensors und schließen Sie die obere Abdeckung des Schleuderbeschichters. Drücken Sie die Starttaste, um die Beschichtung der Probe zu starten und die Maschine zu stoppen, wenn sie fertig ist.
Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, schalten Sie die Netz- und Steuertasten aus und entfernen Sie den Poly-L-Lysin-modifizierten Siliziumdioxidsensor. Um die Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln an PNPE zu bestimmen, schalten Sie den Computer, die elektronische Einheit und die Schlauchpumpe ein und aktivieren Sie die Temperaturregelung unten rechts in der Software, um sicherzustellen, dass die eingestellte Temperatur etwa ein Grad Celsius unter Raumtemperatur liegt. Setzen Sie die Poly-L-Lysin-modifizierten Siliziumdioxidsensoren gemäß der Bedienungsanleitung in die Durchflusszelle ein und verbinden Sie die Messleitung zwischen Durchflusszelle und Durchflusspumpe.
Platzieren Sie die Durchflusszelle im Durchflussmodulsystem. Klicken Sie auf die Erfassungssymbolleiste und wählen Sie Messung einrichten, um nach 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Oktaven des Chips im verwendeten Kanal zu suchen. Um die Basislinie zu korrigieren, klicken Sie auf Messung starten, damit Luft in das Strömungsmodul eindringen kann, bis die Luftbasislinie glatt ist.
Nachdem deionisiertes Wasser 10 bis 15 Minuten lang geflossen ist, um das Ausgangsgleichgewicht der Lösung wieder zu ermöglichen, wird die vorbereitete PNPE-Lösung mit einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute in das Durchflussmodul gepumpt, um eine Gleichgewichtsadsorption auf dem Siliziumdioxidsensor zu erreichen. Pumpen Sie die vorbereitete biomimetische extrazelluläre Vesikellösung mit einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute in das Durchflussmodul, um den Prozess der bEV-Adhäsion an der PNPE-Oberfläche zu verfolgen. Inkubieren Sie die dendritischen Knochenmarkzellen mit 1640 vollständigen Medien für sieben Tage und säen Sie sie dann in kleine konfokale Laserschalen bei 1 mal 10 bis 6 pro Vertiefung über Nacht bei 37 Grad Celsius und einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.
Mischen Sie 0,5 Milliliter Cyanin 5-markiertes Ovalbumin mit 0,5 Milliliter PNPE für eine Stunde und entfernen Sie das fluidische Antigen durch Zentrifugation bei 5.000 G für 20 Minuten, um eine Impfstoffformulierung zu entwickeln. Nach der Resuspension mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser 10 Mikroliter der Formulierung in die kleinen konfokalen Laserschalen unter einer super sauberen Bank geben und sechs Stunden lang mit dendritischen Knochenmarkzellen kokulturieren. Nachdem Sie die Kulturflüssigkeit aus den Zellen entfernt haben, waschen Sie sie zweimal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
Fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehydlösung und PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit PBS zwei- bis dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,5% Triton X-100 Lösung für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie die Zellen erneut mit PBS gewaschen haben, bedecken Sie die Zellen auf der Glasbodenschale der kleinen konfokalen Laserschalen mit 200 Mikrolitern Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierter Phalloidin-Arbeitslösung und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem die Zellen dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS gewaschen wurden, ruhen Sie die Zellkerne für etwa 30 Sekunden mit 200 Mikrolitern DAPI-Lösung auf. Für die Bildanalyse schalten Sie die konfokale Mikroskophardware nacheinander ein, einschließlich Laser, Konfokal, Mikroskop und Computer.
Klicken Sie auf die Software und wählen Sie Nikon Confocal aus, um das Testsystem aufzurufen. Schalten Sie im konfokalen Mikroskopsystem die verschiedenen Einheiten in der angegebenen Reihenfolge ein. Richten Sie zunächst die FITC-, DAPI- und Cy5-Kanäle ein und passen Sie die entsprechenden HV- und Offset-Kanäle an.
Nachdem Sie die 100-fache Öllinse ausgewählt und einen Tropfen Zedernöl auf die Oberseite gegeben haben, legen Sie die kleinen konfokalen Laserschalen mit gefärbten dendritischen Knochenmarkzellen auf den Mikroskoptisch. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen. Unter dem Fluoreszenzmikroskop lokalisieren Sie Zellen von Interesse, indem Sie die x-Achse, y-Achse und z-Achse bewegen.
Stimmen Sie die Laserintensität, Bildgröße und andere Parameter ab, um qualitativ hochwertige konfokale Bilder zu scannen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen und speichern Sie die Bilder. Die Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln an PNPE wurde mit QCM-D verfolgt.
Eine sofortige Abnahme der Häufigkeit zeigte eine schnelle Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln an PNPE nach der Begegnung. Darüber hinaus nahm delta F mit zunehmender biomimetischer extrazellulärer Vesikelkonzentration ab, was einen konzentrationsabhängigen Effekt widerspiegelt. PLGA-Mikropartikel und tensidstabilisierte Nanoemulsionen waren selbst bei hohen Konzentrationen von 80 Mikrogramm pro Milliliter schwach an biomimetische extrazelluläre Vesikel gebunden, was wahrscheinlich auf fehlende Kontaktstellen mit den Immunzellen zurückzuführen war.
Das Cyanin-5-Ovalbumin-Fluoreszenzsignal zeigte, dass die Gesamtmenge des in Zellen internalisierten Antigens in der PNPE-behandelten Gruppe signifikant höher ist als in der Gruppe der PLGA-Mikropartikel und der tensidstabilisierten Nanoemulsion. Die quantitative Analyse der zellulären Aufnahme zeigte eine signifikant höhere relative Intensität von Fluoreszenz- und Knochenmark-dendritischen Zellen, die mit PNPE behandelt wurden, als bei denen, die mit PLGA-Mikropartikeln und tensidstabilisierter Nanoemulsion behandelt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die PNPE die Antigeninternalisierung förderte und das Antigen effektiv intrazellulär abgab.
Um eine homogene Emulsion zu erhalten, muss die Mischung während der Beschallung kontinuierlich geschüttelt werden.
