Die Vena saphena ist nach einer Bypass-Operation der Koronararterien plötzlich arteriellen Erkrankungen ausgesetzt. Das Verständnis seiner Anpassungsreaktion an mechanische Belastungen kann dazu beitragen, therapeutische Instrumente zu entwickeln, um das Versagen eines Venentransplantats zu verhindern. Dieses Protokoll zur Isolierung von Endothelzellen ist sehr einfach und erfordert nur eine Inkubation mit Kollagenase.
Bei minimaler Gefäßmanipulation führt dies zu einer reduzierten Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten. Das Protokoll für die Isolierung humaner SVECs und deren Kultivierung unter Scherbelastung und zyklischer Dehnung ist unerlässlich, um den Beitrag mechanischer Kräfte bei der Dysfunktion von Endothelzellen im Zusammenhang mit dem Versagen des Venentransplantats saphena zu verstehen. Die vorherige Endothelzellkultur ist sehr anspruchsvoll in Bezug auf die Supplementierung mit Zellmedien.
Es ist zwingend erforderlich, Wachstumsfaktoren hinzuzufügen, um eine Kultur, die menschlichen SVECs, erfolgreich zu isolieren. Für die Isolierung von primären humanen Endothelzellen der Vena saphena oder humanen SVECs wird ein mindestens zwei bis drei Zentimeter langes Venensegment der Vena saphena entnommen. Übertragen Sie das Venensegment unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube in eine Petrischale, die mit vorgewärmtem PBS gefüllt ist.
Um das gesamte Blut aus dem Lumen zu entfernen, führen Sie eine Pipettenspitze, die an einer Pipette befestigt und mit PBS gefüllt ist, in ein Ende der Vene ein und spülen Sie sie vorsichtig aus. Spülen Sie es, bis der Waschfluss vollständig klar ist. Verschließen Sie dann ein Ende der Vene mit einer sterilen Baumwollnaht.
Füllen Sie das Gefäß vorsichtig mit einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase-Typ-2-Lösung und verschließen Sie das andere Ende des Gefäßes mit einer Baumwollnaht. Inkubieren Sie das Gefäß mit Kollagenaselösung in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%igem Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Schneiden Sie dann ein Ende des Gefäßes über ein 15-Milliliter-Röhrchen, um die Kollagenase-Lösung aufzufangen, bevor Sie das andere Ende durchschneiden.
Spülen Sie die luminale Oberfläche mit ein bis zwei Millilitern PBS, um alle abgelösten Endothelzellen in der Röhre mit Kollagenase zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Zellpellet in drei bis vier Millilitern vollständigem Endothelzellmedium mit einer zusätzlichen Heparinlösung wieder suspendiert.
Legen Sie die Zellen in eine 60-Millimeter-Zellkulturschale, die mit 3 Gewichtsprozent Gelatine vorbeschichtet ist. Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang in befeuchteter Atmosphäre, ohne das Medium zu wechseln. Wechseln Sie danach das Medium jeden zweiten Tag, ohne die Heparin-Supplementierung hinzuzufügen.
Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden. Je nach Größe und Durchmesser des Venenabschnitts werden die humanen SVECs ein bis vier Tage nach der Extraktion mittels Phasenkontrastmikroskopie visualisiert, um den Grad der Konfluenz und ihre Kopfsteinpflastermorphologie zu beurteilen. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
Den Objektträger der Strömungskammer mit 0,1 Gew.-% Gelatine bestreichen und mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Fluidikeinheit und das sterile Perfusionsset mit 10-Millimeter-Reservoirs auszugleichen, inkubieren Sie diese über Nacht in einer befeuchteten Atmosphäre. Für das Scherspannungsexperiment werden 200.000 Endothelzellen, die in 100 Mikrolitern Nährmedium suspendiert sind, in den gelatinebeschichteten Strömungskammerschieber eingesessen.
Um die Zellen an der Kulturoberfläche zu befestigen, inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang. Setzen Sie das Perfusionsset auf die Fluidikeinheit. Füllen Sie die Reservoirs und das Perfusionsset mit ca. 12 Millilitern vorgewärmtem Endothelzellmedium.
Entfernen Sie Luftblasen aus dem Perfusionsset, um den Füllstand beider Behälter bei fünf Millilitern auszugleichen. Setzen Sie die Fluidikeinheit auf das montierte Perfusionsset ohne Kammerschieber im Inkubator und schließen Sie das Stromkabel an die computergesteuerte Pumpe an. Entfernen Sie durch Ausführen des vordefinierten Protokolls in der Pumpensteuerungssoftware alle Luftblasen aus den Behältern und dem Perfusionsset.
Nehmen Sie die Fluidikeinheit mit dem montierten Perfusionsset an die Laminar-Flow-Haube und befestigen Sie die Objektträger mit einer Konfluenzzellen-Monoschicht. Nachdem Sie das gesamte Gerät mit den Objektträgern in den Inkubator gestellt haben, schließen Sie das Stromkabel an die Pumpe an. Passen Sie in der Pumpensteuerungssoftware die Einrichtung der Fluidikeinheit an, indem Sie den Schiebertyp auswählen und die Viskosität des Mediums einstellen.
Geben Sie unter Strömungsparameter den Wert für die Schubspannung ein und legen Sie die Zyklusdauer und den Strömungstyp fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Abspielen", um das Experiment zu starten. Denken Sie daran, den Objektträger mit Zellen zu pflegen, die mit dem gleichen Medium behandelt wurden, ohne dem Durchfluss wie bei statischen Kontrollen ausgesetzt zu sein.
Tragen Sie silikonbasiertes Schmiermittel auf die Oberseiten und Seiten der 25-Millimeter-6-Well-Beladestation auf. Säen Sie 400.000 Zellen, die in drei Millilitern suspendiert sind, in jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatten mit flexiblem Boden, die mit Kollagen beschichtet sind. Inkubieren Sie die Zellen in befeuchteter Luft, bis sie eine 100%ige Konfluenz erreichen.
Bevor Sie mit dem Streckprotokoll beginnen, waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie drei Milliliter frisches Nährmedium pro Vertiefung hinzu. Setzen Sie die Grundplatte mit allen geschmierten Ladestationen in den Inkubator ein und verbinden Sie den Schlauch entsprechend mit der Steuerungsausrüstung des Spannzellen-Streckbioreaktorsystems. Befestigen Sie jede Kulturplatte an einer roten Dichtung, die vom Bioreaktorsystem bereitgestellt wird.
Legen Sie sie dann in die Bodenplatte im Inkubator. Platzieren Sie alle vier Kulturplatten in der Grundplatte, um eine angemessene Vakuum- und Dehnungsbelastung zu erreichen. Schalten Sie die Controller-Geräte und das Computersystem ein.
Öffnen Sie die FlexCell-Steuerungssoftware und konfigurieren Sie das gewünschte Regime, einschließlich des Prozentsatzes der Dehnung, der Wellenform, der Frequenz und der Zeit. Bewahren Sie die Kur auf. Schalten Sie das Vakuumsystem ein, wählen Sie dann das Programm aus und klicken Sie auf dem Computerbildschirm auf Start, um das Dehnen auszuführen.
Überprüfen Sie, ob sich die Silikonmembran bewegt und die Zellen dehnt. Die adhäsiven Endothelzellen konnten 4 bis 10 Tage nach der Extraktion beobachtet werden. Sie bilden zunächst Zellhaufen, die eine typische Kopfsteinpflaster-Morphologie aufweisen.
Sie exprimierten die EC-Marker CD31 und VE-Cadherin. Die hSVECs sind bei Kultivierung unter Scherbeanspruchung in Strömungsrichtung ausgerichtet. Die Scherspannung von 20 dyn pro Quadratzentimeter für 72 Stunden induziert die Expression der typischen mechanosensitiven Gene KLF2, KLF4 und NOS3, was auf die Wirksamkeit des Scherreizes hinweist.
Das Ergebnis der zyklischen Dehnung hing von der Intensität ab, die auf die menschlichen SVECs angewendet wurde. Zellen mit geringer Dehnung zeigten ein kortikales F-Aktin-Muster, das statischen Zellen ähnelte. Ohne Veränderung der Stickoxidfreisetzung für bis zu 72 Stunden veränderten unsere arteriellen Dehnungsniveaus das Aktin-Zytoskelett nach 24 Stunden und verringerten die NO-Freisetzung nach 72 Stunden.
Neben mechanischen Stressstudien können die Forscher die isolierten Zellen nutzen, um verschiedene Methoden durchzuführen, um das Wissen über die Funktion und Dysfunktion von Endothelzellen zu erweitern. Nach dem demonstrierten Protokoll ist es möglich, jede andere Art von Endothelzellen unter Scherbelastung und Dehnung zu untersuchen.
