Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

Resumen

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Resumen

El cultivo in vitro de células humanas primarias del epitelio bronquial (HBE) usando condiciones de interfaz aire-líquido proporciona un modelo útil para estudiar los procesos de diferenciación celular de las vías respiratorias y la función. En los últimos años, el uso de vectores lentivirales para la entrega transgén se convirtió en una práctica común. Mientras que hay informes de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias completamente diferenciadas con ciertas lentivirus seudo-tecleado sin infección por VIH, la eficiencia global de transducción es generalmente menos de 15%. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente para producir lentivirus y para la transducción de células epiteliales bronquiales humanas primarias. El uso de células epiteliales bronquiales no diferenciadas, la transducción en medio de crecimiento epitelial bronquial, mientras que las células se adhieren, con una multiplicidad de infección de factor de 4 proporciona eficiencias de cerca de 100%. Este protocolo describe, paso a paso, la preparación y la concentración de los vectores de lentivirus de alto título y THproceso de transducción e. Se analizan los experimentos que determinaron las condiciones óptimas de cultivo para lograr la transducción de alta eficiencia de las células epiteliales bronquiales humanas primarias.

Introducción

El desarrollo de los lentivirus, pseudotyped replicación defectuosa (LV) ha proporcionado a los investigadores un método seguro y eficaz para entregar los transgenes in vitro ^1. Debido a su expresión a largo plazo, estos LV también podría ser utilizado para la administración de agentes terapéuticos in vivo ^2,3. La producción de LV requiere co-transfección de riñón embrionario humano (HEK) células con varios plásmidos: vector de transferencia, de la mordaza de embalaje / pol, rev embalaje, y el sobre vesicular glicoproteína del virus de la estomatitis (VSV-G) plásmidos. Sistemas de envasado de tercera generación se consideran más seguros que los sistemas de segunda generación porque el gen rev se codifica en un plásmido de empaquetamiento separado, reduciendo así la posibilidad de recombinación para producir un lentivirus de replicación competente. Aunque los sistemas de envasado de segunda generación producen cinco unidades de transducción totales más altos de plegado, la escisión del genoma viral original para crearel sistema de tercera generación se ha reducido el nivel de transducción sólo mínimamente ^3,4.

Mientras que las líneas de células pueden ser transducidas con mayor facilidad y de manera eficiente, los investigadores han cambiado su enfoque a las células primarias, ya que estos son más representativos de tejidos in vivo ^5,6. Sin embargo, las células primarias son refractarios a la transducción. Si bien se ha informado de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias totalmente diferenciadas, la eficiencia global no ha superado el 15% ^7.

Aquí se describe un protocolo que permite la producción de volúmenes lógicos de alto título. Un enfoque paso a paso se describe para alcanzar casi el 100% la eficacia de transducción en células primarias HBe. Más específicamente, el protocolo describe las condiciones de cultivo óptimas instrumentales para tener éxito ^3. Brevemente, las células HEK 293T se transfectan con el vector de expresión lentiviral Pcdh con el objetivo EF-1 promotor que dirige la expresión de verde fluorescenteproteína (eGFP) o mCherry, una proteína fluorescente de color rojo, y un sistema de envasado de tercera generación. LV liberadas en los medios de comunicación se recogen de 24 a 72 horas más tarde. Las partículas de virus se concentran con polietilenglicol (PEG), un método conveniente y fácil de la concentración viral, antes de la estimación de título usando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima antígeno p24 (ELISA). Posteriormente, las células primarias HBe indiferenciadas son transducidas en medios de proliferación (medio de crecimiento epitelial bronquial o BEGM) ^8, mientras que la fijación (después de ser tripsinizadas), a una multiplicidad de infección (MOI) factor de 4, la adición de bromuro de hexadimetrina e incubando durante 16 hr ( durante la noche). Las células se dejan a diferenciarse. Puesto que el transgén viral se expresa a largo plazo (mediante el promotor apropiado, véase la discusión), la expresión se mantendrá durante la diferenciación en un epitelio de las vías respiratorias pseudostratified o puede ser inducida (usando un promotor inducible) después de la diferenciación.

Este protocolo es de gran interés para los investigadores que desean utilizar células primarias HBe en lugar de líneas celulares, y podría ser adaptable a otros difíciles para la transducción de tipos de células.

Protocolo

1. Etapa 1: Cultivo de células HEK 293T

1. Preparar medios células HEK (referido como medios HEK) mediante la adición de 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina al alto nivel de glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM).
2. Escudo una placa de 10 cm de cultivo de tejidos con colágeno I. Se mezclan 30 l de colágeno I en 2 ml de agua destilada. Corre la mezcla en el plato y se incuba durante 2 horas a 37 ° C y 5% de _CO2.
3. Retire la mezcla y dejar que el plato de seco en una cabina de flujo laminar durante 15 minutos.
4. Células de la placa HEK sobre el plato recubierto a una densidad de células de 1 x 10 ⁶ en 10 ml de medio HEK y se incuba a 37 ° C y 5% de CO _2.
5. Cuando las células HEK son 50-60% de confluencia (Figura 1a, 2-3 días después de la siembra), pasar a la Fase 2. Evaluación visual de la confluencia es suficiente. No se necesita la cuantificación.
   Nota: las células HEK se cultivan en medio HEK (ver arriba). Cuando alcanzan la confluencia, tey se puede dividir (por ejemplo 1/5) o congelados para futuros usos.

2. Etapa 2: producción y concentración de lentivirus (LV) en células HEK

Nota: Los protocolos deben ser ejecutados de acuerdo con las normativas institucionales y gubernamentales bajo condiciones (+ mejoradas BSL-2) en el EE.UU. BSL-2.

1. Transfectar usando un procedimiento de precipitación de calcio (lipofectamina y otros agentes de transfección no eran tan eficiente como el procedimiento de precipitación de calcio). Se recomienda el uso de un kit de transfección comercial para asegurar la reproducibilidad, aunque el procedimiento se modifica de la siguiente manera. Mantener los reactivos a temperatura ambiente. Este es el día 0.
2. Para cada placa de 10 cm de células HEK293, mezclar 4,5 g de dotación de ADN PMD2-VSVG, 7,5 g de envases de ADN pMDLg / pRRE, 3,75 g de ADN pRSV- rev, 10 g de ADN del vector de expresión lentiviral, 86 l de una solución de calcio 2 M y agua estéril en un tubo de centrífuga de 15 ml hasta un volumen final de 700 l(Estas dos últimas soluciones se proporcionan en el kit de transfección comercial).
3. Gota a gota, añadir 700 l de solución salina tamponada con HEPES (HBS 2x, proporcionados en el kit de transfección), mientras que un vórtex (en la campana de flujo laminar) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min (realizar el paso 4 a la espera).
4. Durante el tiempo de incubación temprana, depósito de 5 l de la mezcla en un portaobjetos. Compruebe que la gota bajo un microscopio con un objetivo de 10X, centrándose lentamente hacia arriba y hacia abajo. Un precipitado fino debe ser visible, lo que confirma el proceso de precipitación de fosfato de calcio (Figura 1b).
5. Detener la precipitación después de 30 minutos mediante la adición de 10 ml de células HEK medios de comunicación y la pipeta hacia arriba y abajo para mezclar.
6. Sacar la fuente de las células HEK desde el paso 2,1-2,5, y se elimina el medio (día 0). Añadir la solución de precipitado de la etapa 2.5 con cuidado y lentamente a lo largo del borde del plato.
7. Al día siguiente (día 1), retirar y desechar el medio que contiene el precipitado y reemplazarlo wITH 10 ml de medio HEK. Comprobar si el precipitado fino bajo el microscopio: debe ser visible en el plato en los espacios vacíos entre las células (Figuras 1c y D).
8. En el día 2, los medios de comunicación recoger con una jeringa, filtro a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 3,8 ml de un polietilenglicol 40% de solución (PEG). Invertir 5x para mezclar y almacenar a 4 ° C durante al menos 24 horas (para el PEG precipitar para formar, pero no más de 5 días) hasta que todas las colecciones de virus están completos.
9. Repita el paso 2.8 en los días 3 y 4. En el día 4 no reemplazan con medio HEK pero descontaminar con un 10% de lejía y desechar el plato.
10. Centrifugar todos los tubos de recogida (por lo general todas las colecciones reúnen en el día 5) a 1.650 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar el virus. Retirar y desechar el sobrenadante, y girar de nuevo a 1.650 xg durante 5 min a 4 ° C para recoger y eliminar cualquier resto de PEG sobrenadante.
11. ResusPend el sedimento de cada tubo en 200 l de medio de crecimiento epitelial bronquial (BEGM) sin anfotericina B ^8. a un fondo común y la alícuota en 200 l. virus de la tienda a -80 ° C. Alícuota de un 10 l adicionales para llevar a cabo el VIH-1 Gag ensayo ELISA (p24) antígeno.
12. El uso de un kit de ELISA comercial, realizar un ensayo de antígeno p24 según el protocolo del fabricante. El ensayo da una estimación de p24 viral en pg / ml.

3. Etapa 3: células de cultivo primario HBE

1. Células de la placa HBE en 10 ml de medio BEGM (con 100 l de anfotericina B si se utilizan pasaje 0 células para eliminar la posible contaminación por hongos) a una densidad de células de 1 x 10 ⁶ en un colágeno I recubren 10 cm placa de cultivo tisular. Se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2.
2. Al día siguiente, se elimina el medio y reemplazar con 10 ml BEGM (con 100 l de anfotericina B para el paso 0 células) para un total de 4 días. Retorno a la incubadora.
3. Después de 4 díasays, utilizan sólo BEGM sin medios anfotericina B. Cambio cada dos días.
4. Cuando las células son 80-90% de confluencia (Figura 2a; ~ 7 días después de la siembra), siga los pasos de transducción (prestar atención a 3.5 para la preparación antes de la transducción). Una vez más, la evaluación visual de confluencia es suficiente. No se necesita la cuantificación.
5. Antes de la transducción, capa los insertos de soporte permeable con una solución de colágeno IV diluye 1/10 con agua destilada estéril. Añadir 200 l de cada inserto y dejar secar durante la noche en la campana de flujo laminar.

4. Etapa 4: Transducción de células HBE

1. Retire el medio, añadir 3 ml de 0,1% de tripsina en ácido etilendiaminotetraacético 1 mM en solución salina tamponada con fosfato (EDTA / PBS) y se incuba 5 min a 37 ° C y 5% de CO _2. Compruebe bajo el microscopio (objetivo de 10X) para ver si se desprenden todas las células. Si no es así, volver a la incubadora durante 5 minutos adicionales.
2. Cuando se separan todas las células, añadir 3ml de inhibidor de tripsina de soja (SBTI 1 mg / ml), mezclar y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml. Sedimentar las células por centrifugación a 460 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Retire sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en 3 ml de BEGM y proceder con el conteo.
4. Resuspender las células HBE (ahora paso 1 o P1) en una proporción de 2 x 10 ⁵ células por un inserto de soporte permeable 12 mm en 400 l de BEGM (ver Tabla 2). Extrapolar estos números basados ​​en la cantidad de inserciones de soporte permeable que serán transducidas.

Superficie	Área de superficie	recuento de células	Medios de comunicación	Volumen (medios de comunicación)
plato de 10 cm	52,7 cm 2	1 x 10 6	BEGM	10 ml
filtro de 12 mm	1.13 cm 2	2 x 10 5	BEGM	400 l
filtro de 24 mm	4.52 cm 2	8 x 10 5	BEGM	800 l

Tabla 2: Los medios de extrapolación por el recuento de células.

5. El uso de una multiplicidad de infección de los factores (MOI) de 4, añadir el volumen apropiado de virus a la suspensión celular.
6. Añadir bromuro de hexadimetrina a una concentración final 2 mg / ml.
7. Dispensar 400 l de la mezcla (BEGM, HBE células, virus y bromuro de hexadimetrina) por inserto de soporte permeable en el compartimiento apical, y añadir 1 ml de BEGM solo al compartimiento basolateral. Incubar toda la noche a 37 ° C y 5% de CO _{2. Las} células Siempre placa HBE sin virus como el control y la selección de puromicina prueba si procede.
8. En el día siguiente, remmedios apical y basolateral ove, se lavan con PBS y se reemplazan ambos compartimentos con interfaz de aire-líquido medios de comunicación (ALI) ^8.
9. Cuando las células son confluentes, extraer el líquido apical (conocido como el establecimiento de una interfaz aire-líquido). Continuar cambiando el medio (ALI) en el compartimento inferior cada dos días hasta que alcanzan su plena madurez; generalmente de 3 a 4 semanas más tarde.
   Nota: Si el vector lentiviral contiene un gen de selección tal como puromicina, las células se pueden seleccionar mediante la adición de puromicina de acuerdo con una curva de concentración de selección. Para las células HBE, una concentración de 1 mg / ml se ha determinado que es ideal para la selección consistente de células transducidas. Sin embargo, esta concentración puede ser diferente para otras células o condiciones y debe ser determinado por matar curvas. Además de puromicina puede comenzar tan pronto como un día después de que los medios de comunicación ha sido sustituido por los medios de comunicación ALI o posterior (2-3 días) para permitir la plena expresión del gen de selección. Asegúrese de añadir puromicina a un inserto que hcomo no se han transducido. Puromicina se puede añadir hasta que las células están completamente diferenciadas.

Resultados

La figura 1 representa diferentes pasos clave de la evaluación de las células y las soluciones durante el proceso de transfección. La Figura 1A muestra la confluencia óptima de las células HEK293T antes de la transfección para la producción de virus. Es importante que las células se distribuyen uniformemente por todo el plato. Figura 1b revela el precipitado en una gota de la mezcla de transfección usando la óptica de campo cla...

Discusión

El protocolo descrito aquí asegura cerca de 100% de eficiencia de transducción. Sin embargo, hay algunos pasos durante el proceso que son importantes para lograr este objetivo. Por ejemplo, durante el proceso de transfección, la presencia de precipitados en la mezcla de transducción (caída) o en el plato de la días después de la transducción (Figuras 1b y d) son relevantes para una buena transfección. La ausencia de un precipitado o la presencia de aglomerados puede ser debido ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12 mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA