Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen

Zusammenfassung

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Zusammenfassung

In - vitro - Kultur von primären humanen bronchialen Epithelzellen (HBE) Zellen unter Verwendung von Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche Bedingungen ein nützliches Modell stellt die Prozesse der Atemwegszelldifferenzierung und Funktion zu untersuchen. In den letzten Jahren wurde die Verwendung von lentiviralen Vektoren für die Transgen Lieferung gängige Praxis. Während es Berichte über Transduktion von vollständig differenzierten Epithelzellen der Atemwege mit bestimmten nicht-HIV pseudo-typisierten Lentiviren sind, ist die Gesamt Transduktionseffizienz in der Regel weniger als 15%. Das Protokoll vorgestellt hier stellt eine zuverlässige und effiziente Methode Lentiviren zu produzieren und primären humanen bronchialen Epithelzellen zu transduzieren. Verwendung undifferenzierter bronchialen Epithelzellen, Transduktion in bronchial epithelial Wachstumsmedien, während die Zellen anschließen, mit einer Multiplizität der Infektion Faktor 4 stellt Wirkungsgrade nahe 100%. Dieses Protokoll beschreibt, Schritt-für-Schritt, der Herstellung und der Konzentration von hohem Titer lentiviralen Vektoren und the Transduktionsprozesses. Es werden die Experimente, die die optimalen Kulturbedingungen bestimmt hocheffiziente Transduktionen von primären humanen bronchialen Epithelzellen erreichen.

Einleitung

Die Entwicklung von replikationsdefektiven, pseudotypisiertem Lentiviren (LV) hat mit einem sicheren und effizienten Methode Forscher bereitgestellt Transgenen in vitro ¹ zu liefern. Aufgrund ihrer langfristigen Expression könnte diese LV auch für die Abgabe von therapeutischen Mitteln in vivo ^2,3 verwendet werden. Die Herstellung von LV erfordert die Cotransfektion von menschlichen embryonalen Nieren (HEK - Zellen) mit verschiedenen Plasmiden: Transfervektor, Verpackungs gag / pol, rev Verpackung und umhüllen vesikulären Stomatitis - Virus - Glycoprotein (VSV-G) Plasmiden. Die dritte Generation der Verpackungssysteme sind als sicherer als Systeme der zweiten Generation , weil die rev - Gen auf einem separaten Verpackung Plasmid codiert wird, wodurch die Möglichkeit der Rekombination Reduzieren eines Replikations - kompetenten Lentiviren zu erzeugen. Obwohl der zweiten Generation Verpackungssysteme fünffach höhere Gesamtübertragungseinheiten ergeben, auf die Spaltung des ursprünglichen viralen Genoms erstellendas System der dritten Generation hat sich nur minimal ^3,4 die Höhe der Übertragungs verringert.

Während Zelllinien können einfacher und effizienter transduziert werden, haben Forscher ihren Fokus auf Primärzellen verschoben werden , da diese mehr repräsentativ für in vivo ^5,6 Geweben. Allerdings sind Primärzellen refraktär Transduction. Während Transduktion von Epithelzellen der Atemwege ausdifferenzierten berichtet hat der Gesamtwirkungsgrad 15% ⁷ nicht überschritten wird .

Hier beschrieben ist ein Protokoll, das die Produktion von LVs mit hohem Titer ermöglicht. Ein Schritt-für-Schritt-Ansatz skizziert nahezu 100% Transduktionseffizienz in primäre HBE-Zellen zu erreichen. Genauer gesagt beschreibt das Protokoll , um die optimalen Kulturbedingungen instrumental ³ erfolgreich zu sein. Kurz gesagt, werden HEK 293T-Zellen-Promotor die Expression von enhanced green fluorescent mit dem lentiviralen Expressionsvektor pcdh mit dem EF-1 transfiziertProtein (eGFP) oder mCherry, ein rot fluoreszierendes Protein und ein Verpackungssystem der dritten Generation. LVs in den Medien veröffentlicht werden 24 bis 72 Stunden später gesammelt. Die Viruspartikel mit Polyethylenglykol (PEG) konzentriert, eine bequeme und einfache Methode der viralen Konzentration vor Titer Schätzungs ein p24-Antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit. Anschließend werden undifferenzierte primäre HBE - Zellen in Proliferationsmedium (bronchiale epitheliale Wachstumsmedium oder BEGM) transduziert ^8, während Anbringen (nach trypsiniert wird), bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) Faktor 4, Hexadimethrinbromid Zugabe und für 16 Stunden inkubiert ( über Nacht). Die Zellen werden dann zu differenzieren gelassen. Da die virale Transgen langfristig (unter Verwendung des geeigneten Promotor, siehe Diskussion) ausgedrückt wird, wird die Expression im gesamten Differenzierung in einem mehrreihigen Luftwegsepithel gehalten werden oder kann (unter Verwendung eines induzierbaren Promotors) nach der Differenzierung induziert werden.

Dieses Protokoll ist von großem Interesse für Forscher, die anstelle von Zelllinien, primären HBE-Zellen verwendet werden soll, und könnte auf andere schwer anpassbar sein Zelltypen zu transduzieren.

Protokoll

1. Stufe 1: Kultur von HEK 293T

1. Bereiten HEK-Zellen-Medien (wie HEK Medien bezeichnet) um 10% Zusatz (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin zu hohen Glukose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM).
2. Mantel eine 10 cm-Gewebekulturschale mit Kollagen I. Mix 30 ul Kollagen I in 2 ml destilliertem Wasser. Verbreiten Sie die Mischung auf dem Teller und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
3. Entfernen Sie die Mischung und lassen Sie die Schale trocken in einem Laminar-Flow-Schrank für 15 min.
4. Platte HEK - Zellen auf die beschichtete Schale bei einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen in 10 ml HEK Medien und Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Wenn HEK - Zellen 50-60% konfluent (Abbildung 1a, 2-3 Tage nach der Plattierung) sind, gehen 2. Visuelle Beurteilung der Konfluenz zu Stufe ist ausreichend. Keine Quantifizierung erforderlich.
   Anmerkung: HEK-Zellen, sind in HEK Medium (siehe oben). Wenn sie Konfluenz erreichen, they kann für die spätere Verwendung aufgeteilt (zB 1/5) oder eingefroren.

2. Stufe 2: Herstellung und Konzentration von Lentiviren (LVs) in HEK-Zellen

Hinweis: Die Protokolle sollten mit institutionellen und staatlichen Vorschriften unter BSL-2 + (Enhanced BSL-2) Bedingungen in den USA in Zeile ausgeführt werden.

1. Transfizieren eine Calciumfällungsverfahren unter Verwendung von (Lipofectamin und anderen Transfektionsmittel waren nicht so effizient wie der Calciumausfällung Verfahren). Verwendung eines handelsüblichen Transfection Kit empfohlen Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wenn das Verfahren wie folgt modifiziert. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur. Dies ist Tag 0.
2. Für jede 10 cm Schale von HEK293-Zellen, 4,5 ug Umschlag DNA PMD2-VSVG, 7,5 ug Verpackung DNA pMDLg / pRRE, 3,75 g DNA pRSV-rev, 10 ug DNA von lentiviralen Expressionsvektor mischen, 86 ul einer 2 M Calciumlösung und steriles Wasser in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 700 ul(Letztere beiden Lösungen werden in der kommerziellen Transfection Kit bereitgestellt).
3. Tropfenweise, fügen Sie 700 ul 2x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS, bei der Transfektion Kit enthalten), während Verwirbelung (im Laminarflowbox) und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur (führen Sie Schritt 4 während des Wartens).
4. Während der frühen Inkubationszeit Ablagerung 5 ul der Mischung auf einer Folie. Schauen Sie sich die Tröpfchen unter einem Mikroskop mit einem 10X-Objektiv, die sich langsam auf und ab. Ein feiner Niederschlag sollte sichtbar sein, der Calciumphosphat - Fällungsverfahren bestätigt (Abbildung 1b).
5. Stoppen Sie die Fällung nach 30 Minuten durch Zugabe von 10 ml HEK-Zellen Medien und Pipette nach oben und unten zu mischen.
6. Nehmen Sie die Schale von HEK-Zellen aus Schritt 2,1-2,5, und entfernen Sie das Medium (Tag 0). Fügen Sie den Niederschlag Lösung aus Schritt 2.5 vorsichtig und langsam am Rand der Schale.
7. Am nächsten Tag (Tag 1), zu entfernen und das Medium, das den Niederschlag verwerfen und ersetzen Sie es with 10 ml HEK Medium. Prüfen Sie, ob der feine Niederschlag unter dem Mikroskop: Es sollte in der Schale in leeren Räumen zwischen den Zellen (Abbildungen 1c und d) zu sehen sein.
8. Am Tag 2 sammeln Medien mit einer Spritze, filtriert durch ein 0,45 um-Spritzenfilter in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen 3,8 ml einer 40% Polyethylenglycol (PEG) -Lösung enthält. Invert 5x zu mischen und bei 4 ° C für mindestens 24 h (für die PEG bilden auszufallen, aber nicht mehr als 5 Tage), bis alle der Virensammlungen sind abgeschlossen.
9. Wiederholen Sie Schritt 2.8 an den Tagen 3 und 4. Am Tag 4 nicht mit HEK Medium ersetzen, sondern mit 10% Bleichmittel dekontaminieren und die Schale wegwerfen.
10. Zentrifuge alle Sammelrohre (in der Regel alle Sammlungen zusammen am Tag 5) bei 1.650 xg für 20 min bei 4 ° C, um das Virus zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und Spin wieder bei 1.650 × g für 5 Minuten bei 4 ° C zu sammeln und entfernen Sie alle verbleibenden von PEG-Überstand.
11. ResusPEND das Pellet jeder Röhre in 200 ul bronchiale Epithel - Wachstumsmedium (BEGM) ohne Amphotericin B ^8. Pool sie zusammen und aliquoten bei 200 & mgr; l. Store-Virus bei -80 ° C. Aliquotieren zusätzliche 10 ul der HIV-1 Gag (p24) Antigen ELISA-Assay durchzuführen.
12. Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen ELISA-Kit, führen Sie eine p24-Antigen-Test nach dem Protokoll des Herstellers. Der Test gibt eine Schätzung der viralen p24 in pg / ml.

3. Stufe 3: Kultur Primäre HBE-Zellen

1. Platte HBE - Zellen in 10 ml BEGM Medium (mit 100 & mgr; l Amphotericin B , wenn Passage 0 - Zellen werden verwendet , um mögliche Pilzkontamination zu eliminieren) bei einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen in einer Kollagen I 10 cm Gewebekulturschale aufgebracht. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Medium und ersetzen mit 10 ml BEGM (mit 100 & mgr; l Amphotericin B für die Passage 0-Zellen) für insgesamt 4 Tage. Rückkehr zum Inkubator.
3. Nach 4 days, verwenden Sie nur BEGM ohne Amphotericin B. Wechsel jeden zweiten Tag Medien.
4. Wenn die Zellen 80-90% konfluent (Abbildung 2a; ~ 7 Tage nach der Plattierung) sind, mit Transduktion gehen (achten Sie auf 3,5 für die Vorbereitung vor Übertragung). Auch hier ist die visuelle Beurteilung von Konfluenz ausreichend. Keine Quantifizierung erforderlich.
5. Vor der Transduktion, beschichten die durchlässigen Stützeinlagen mit einer Kollagen-IV-Lösung verdünnt 1/10 mit sterilem destilliertem Wasser. In 200 ul zu jedem Einsatz und trocknen lassen über Nacht im Laminarflowbox.

4. Stufe 4: Transduction von HBE-Zellen

1. Entfernen Medien, 3 ml 0,1% Trypsin in 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure in phosphatgepufferter Salzlösung (EDTA / PBS) und inkubiere 5 min bei 37 ° C und 5% CO _2. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (10X-Objektiv), um zu sehen, ob alle Zellen abgelöst werden. Wenn nicht, Rückkehr in den Inkubator für weitere 5 min.
2. Wenn alle Zellen abgelöst werden, fügen Sie 3ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (SBTI 1 mg / ml), mischen und in ein Rohr 15 ml Zentrifugen. Pelletieren Sie die Zellen von bei 460 xg für 5 min bei Raumtemperatur zu drehen.
3. Überstand entfernen und Pellet in 3 ml BEGM und fahren Sie mit dem Zählen.
4. Resuspendieren HBE - Zellen (Passage nun 1 oder P1) in einem Verhältnis von 2 x 10 ⁵ Zellen pro 12 mm permeable Stützeinsatz in 400 ul BEGM (siehe Tabelle 2). Extrapolieren diese Zahlen bezogen auf die Menge der durchlässigen Stützeinlagen, die transduziert werden.

Oberfläche	Oberfläche	Anzahl der Zellen	Medien	Volume (Medien)
10-cm-Schale	52,7 cm 2	1 x 10 & sup6 ;	BEGM	10 ml
12 mm Filter	1,13 cm 2	2 x 10 & sup5 ;	BEGM	400 ul
24 mm Filter	4,52 cm 2	8 x 10 & sup5 ;	BEGM	800 ul

Tabelle 2: Medien Extrapolation pro Zellzahl.

5. Verwendung einer Multiplizität der Infektion (MOI) Faktor 4, fügen Sie das entsprechende Volumen des Virus an die Zellsuspension.
6. Hinzufügen Hexadimethrinbromid in ein 2 & mgr; g / ml Endkonzentration.
7. Dispense 400 ul der Mischung (BEGM, HBE Zellen, Viren und Hexadimethrinbromid) pro durchlässigen Trägereinsatz in das apikale Kompartiment und 1 ml BEGM allein zur basolateralen Fach. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2. Immer Platte HBE - Zellen ohne Virus als Kontroll- und Test Puromycin Auswahl falls zutreffend.
8. Am nächsten Tag, remove apikalen und basolateralen Medien, waschen mit PBS, und ersetzen Sie beide Kammern mit Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche (ALI) Medien ^8.
9. Wenn die Zellen konfluent sind, entfernen apikalen Fluid (bekannt als ein Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche zur Festlegung). Weiter das Medium (ALI) in der unteren Kammer Wechsel jeden zweiten Tag, bis sie ihre volle Reife erreichen; Regel 3 bis 4 Wochen später.
   Hinweis: Wenn der lentiviralen Vektor ein Selektionsgen wie Puromycin enthält, können die Zellen durch Zugabe von Puromycin ausgewählt werden, entsprechend einer Auswahl Konzentrationskurve. Für HBE-Zellen, eine Konzentration von 1 ug / ml wurde für eine konsistente Selektion von transduzierten Zellen ideal zu sein, bestimmt. Allerdings könnte diese Konzentration für andere Zellen oder Bedingungen unterscheiden und durch Abtöten Kurven bestimmt werden. Die Zugabe von Puromycin kann so früh wie ein Tag starten, nachdem die Medien von ALI Medien oder später ersetzt worden (2-3 Tage), um den vollen Ausdruck des Selektionsgens zu ermöglichen. Achten Sie darauf, Puromycin zu einem Einsatz, dass h hinzufügennicht transduziert wurden. Puromycin können hinzugefügt werden, bis die Zellen vollständig differenziert sind.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt verschiedene wichtige Schritte von Zellen und Lösungen während der Transfektionsprozess bewerten. Abbildung 1a zeigt die optimale Konfluenz von HEK293T - Zellen vor der Transfektion für die Virusproduktion. Es ist wichtig , dass die Zellen gleichmäßig über die Schale verteilt sind. 1b den Niederschlag in einem Tropfen der Transfektionsgemisch Verwendung Hellfeldoptik und einem 10X - Objektiv zeigt. Je mehr die Pr?...

Diskussion

Das Protokoll hier skizzierte sichert zu 100% Transduktionseffizienzen schließen. Allerdings gibt es Schritte während des Prozesses, sind wichtig, dieses Ziel zu erreichen. Zum Beispiel während der Transfektionsprozess das Vorhandensein von Präzipitaten in der Transduktion mix (drop) oder in der Schale am Tag nach der Transduktion (Figuren 1b und d) sind sowohl relevant für eine gute Transfektion. Das Fehlen eines Niederschlag oder das Vorhandensein von Agglomeraten zu einer Auslas...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA