Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

Resumo

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Resumo

A cultura in vitro de células primárias humanas epiteliais brônquicas (HBE) usando condições de interface ar-líquido fornece um modelo útil para estudar os processos de diferenciação e função das células das vias aéreas. Nos últimos anos, o uso de vectores lentivirais para a entrega do transgene tornou-se prática comum. Embora existam relatórios de transdução de células epiteliais das vias respiratórias totalmente diferenciadas com certos lentivírus digitado pseudo-não-HIV, a eficiência global de transdução é geralmente inferior a 15%. O protocolo aqui apresentado proporciona um método fiável e eficiente para a produção de lentivírus e a transdução de células epiteliais brônquicas humanas primárias. Usando células epiteliais brônquicas indiferenciadas, transdução em meio de crescimento epitelial brônquica, enquanto as células fixar, com uma multiplicidade de infecção de factor de 4 fornece eficiências perto de 100%. Este protocolo descreve, passo-a-passo, a preparação e concentração dos vectores lentivirais de título elevado e thprocesso de transdução de e. Discute-se as experiências que determinaram as condições de cultura ideais para atingir transduções altamente eficientes de células epiteliais brônquicas humanas primárias.

Introdução

O desenvolvimento de lentivírus, pseudotipados replicação deficiente (LV) forneceu aos investigadores um método seguro e eficiente para entregar transgenes in vitro ^1. Devido à sua expressão a longo prazo, estes LV também poderia ser utilizada para a entrega de agentes terapêuticos in vivo ^2,3. A produção de LV requer a co-transfecção de células de rim embrionário humano (HEK) com vários plasmídeos: vector de transferência, gag / pol de empacotamento, rev embalagem, e envelope glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) plasmídeos. Sistemas de empacotamento de terceira geração são considerados mais seguros do que os sistemas de segunda geração, porque o gene rev é codificada num plasmídeo de empacotamento separada, reduzindo assim a possibilidade de recombinação para produzir um lentivírus competente de replicação. Embora os sistemas de embalagem de segunda geração deu cinco unidades de transdução totais mais elevados de dobra, a divisão do genoma viral original para criaro sistema de terceira geração diminuiu o nível de transdução de apenas minimamente ^3,4.

Enquanto linhas celulares podem ser transduzidas mais facilidade e eficiência, os investigadores mudaram seu foco para as células primárias, porque estes são mais representativos de tecidos in vivo ^5,6. No entanto, as células primárias são refratários a transdução. Enquanto a transdução de células epiteliais das vias aéreas totalmente diferenciadas têm sido relatados, a eficiência global não excedeu 15% ^7.

Aqui descrito é um protocolo que permite a produção de LVS-de título elevado. Uma abordagem passo-a-passo é delineada para atingir quase 100% de eficiência de transdução em células HBE primários. Mais especificamente, o protocolo descreve as condições óptimas de cultura para ter sucesso ³ instrumentais. Resumidamente, as células HEK 293T são transfectadas usando o pCDH lentiviral vector de expressão com o promotor de EF-1 dirigindo a expressão de verde fluorescente melhoradaproteína (eGFP) ou mCherry, uma proteína fluorescente vermelha, e um sistema de empacotamento de terceira geração. LVs libertados para os meios de comunicação são coletadas de 24 a 72 horas mais tarde. As partículas de vírus são concentradas com polietilenoglicol (PEG), um método conveniente e fácil de concentração virai, antes da estimação título utilizando um kit de ensaio imuno antigénio p24 ligado a enzima (ELISA). Subsequentemente, as células HBE primárias indiferenciadas são transduzidas em meios de proliferação (meio de crescimento epitelial brônquica ou BEGM) ^8, quando a montar (depois de ser tripsinizadas), a uma multiplicidade de infecção factor 4 (MOI), a adição de brometo de hexadimetrina e incubando durante 16 horas ( pernoite). As células são então deixadas diferenciar. Uma vez que o transgene é expresso viral a longo prazo (usando o promotor apropriado, ver discussão), expressão vai ser mantida durante toda a diferenciação em um epitélio das vias respiratórias pseudo ou pode ser induzida (utilizando um promotor indutível) após a diferenciação.

Este protocolo é de grande interesse para pesquisadores que desejam usar células HBE primários em vez de linhas celulares, e pode ser adaptável a outros difíceis de transdução de tipos de células.

Protocolo

1. Fase 1: Cultura da HEK 293T

1. Prepare meios células HEK (referido como meio de HEK) por adição de 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a elevada glicose de Eagle Modificado Meio de Dulbecco (DMEM).
2. Bata de um prato de 10 cm de cultura de tecidos com colagénio I. Mistura de 30 ul de colagénio I, em 2 ml de água destilada. Espalhar a mistura sobre o prato e incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
3. Remover a mistura e deixar secar o prato numa câmara de fluxo laminar durante 15 min.
4. Placa células HEK para a placa revestida a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células em 10 ml de meio de HEK e incubar a 37 ° C e 5% de CO _2.
5. Quando as células HEK são 50-60% confluentes (Figura 1a, 2-3 dias após o plaqueamento), prossiga para a fase 2. Visual avaliação da confluência é suficiente. Sem quantificação é necessária.
   Nota: as células HEK são cultivadas em meios de HEK (ver acima). Quando eles atingem a confluência, tEi pode ser dividido (por exemplo, 1/5) para baixo ou congelado para uma utilização posterior.

2. Fase 2: Produção e Concentração dos lentivírus (VEs) em células HEK

Nota: Os protocolos devem ser executadas em conformidade com as normas institucionais e governamentais sob + condições (Enhanced BSL-2) nos EUA BSL-2.

1. Transfectar utilizando um procedimento de precipitação de cálcio (lipofectamina e outros agentes de transfecção não fosse tão eficiente quanto o procedimento de precipitação de cálcio). O uso de um kit comercial de transfecção é recomendado para assegurar a reprodutibilidade, embora o processo é modificado como se segue. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente. Este é o dia 0.
2. Para cada placa de 10 cm de células HEK293, misturar 4,5 g de envelope de ADN PMD2-VSVG, 7,5 ug de embalagem ADN pMDLg / pRRE, 3,75? G de ADN de pRSV-Rev, 10 ug de ADN do vector de expressão de lentivírus, 86 ul de uma solução 2 M de cálcio , e água estéril num tubo de centrífuga de 15 ml para um volume final de 700 ul(As duas últimas soluções são fornecidas no kit de transfecção comercial).
3. Gota a gota, adicionar 700 ul de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS, fornecidas com o kit de transfecção) aquando da mistura (na câmara de fluxo laminar) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min (efectuar o passo 4, enquanto espera).
4. Durante o tempo de incubação inicial, depósito de 5 ul da mistura sobre uma lâmina. Verifique a gota sob um microscópio com uma objetiva de 10X, concentrando-se lentamente para cima e para baixo. Um precipitado fino deve ser visível, confirmando o processo de precipitação de fosfato de cálcio (Figura 1b).
5. Pare a precipitação após 30 minutos por adição de 10 ml de células HEK media e pipeta cima e para baixo para misturar.
6. Leve o prato de células HEK do passo 2,1-2,5, e remover o meio (dia 0). Adicionar a solução do passo 2.5 precipitado cuidadosamente e lentamente ao longo da borda do prato.
7. No dia seguinte (dia 1), remova e descarte o meio contendo o precipitado e substituí-lo wom 10 ml de meio de HEK. Verifique se o precipitado fino sob o microscópio: deve ser visível no prato em espaços vazios entre as células (Figuras 1C e D).
8. No dia 2, recolhe meios de comunicação com uma seringa, filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 um para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 3,8 ml de um polietileno-glicol 40% (PEG). Inverter 5x para misturar e armazenar a 4 ° C durante pelo menos 24 horas (para precipitar o PEG para formar, mas não mais do que 5 dias) até que todos os conjuntos de vírus estão completas.
9. Repita o passo 2.8 nos dias 3 e 4. No dia 4 não coloque meio HEK mas descontaminar com 10% de água sanitária e rejeitar a placa.
10. Centrífuga de todos os tubos de colheita (geralmente todas as coleções em conjunto no dia 5) a 1.650 g durante 20 min a 4 ° C para sedimentar o vírus. Retirar e descartar o sobrenadante, e girar novamente a 1.650 xg por 5 min a 4 ° C para recolher e remover qualquer remanescente de PEG sobrenadante.
11. Resuspend a pelete de cada tubo, em 200 ul de meio de crescimento epitelial brônquica (BEGM) sem anfotericina B ^8. Reuni-los em conjunto e a aliquota de 200 ul. vírus armazenar a -80 ° C. Alíquota um adicional de 10 ul de realizar o ensaio ELISA Gag de HIV-1 (p24) antigénio.
12. Utilizando um kit de ELISA comercial, realizar um ensaio de antígeno p24 de acordo com o protocolo do fabricante. O ensaio dá uma estimativa da p24 viral em pg / ml.

3. Fase 3: células de cultura primária HBE

1. Placa HBE células em 10 ml BEGM meios (100 ul com anfotericina B se 0 passagem células são usados ​​para eliminar a possibilidade de contaminação por fungos) a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células em colagénio I revestido 10 centímetros prato de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. No dia seguinte, remover o meio e substituir por 10 ml BEGM (com 100 ul de anfotericina B por células passagem 0) para um total de 4 dias. Voltar para incubadora.
3. Após 4 days, use apenas BEGM sem meios anfotericina B. Alterar a cada dois dias.
4. Quando as células são 80-90% confluentes (Figura 2a; ~ 7 dias após o plaqueamento), proceda com a transdução (preste atenção a 3,5 para preparação antes de transdução). Novamente, a avaliação visual de confluência é suficiente. Sem quantificação é necessária.
5. Antes de transdução, revestir os insertos de suporte permeável com uma solução de colagénio IV diluídos a 1/10 com água destilada estéril. Adicionar 200 mL de cada inserção e deixar secar durante a noite na câmara de fluxo laminar.

4. Etapa 4: Transdução de Células HBE

1. Remover o meio, adicionar 3 ml de tripsina a 0,1% em ácido etilenodiaminotetracético 1 mM em salino tamponado com fosfato (EDTA / PBS) e incuba-se 5 minutos a 37 ° C e 5% de CO _2. Verifique sob o microscópio (objetiva de 10X) para ver se todas as células são separadas. Se não, voltar para a incubadora para um adicional de 5 min.
2. Quando todas as células são separadas, adicione 3ml de inibidor de tripsina de soja (SBTI 1 mg / ml), misturar e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml. Agregar as células por centrifugação a 460 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Remover o sobrenadante e pellet ressuspender em 3 ml de BEGM e prosseguir com a contagem.
4. Ressuspender as células (HBE agora uma passagem ou P1) a uma razão de 2 x 10 ⁵ células por um suporte permeável a inserção de 12 mm de 400 ul de BEGM (ver Tabela 2). Extrapolar estes números com base na quantidade de pastilhas de suporte permeável que vai ser transduzidas.

Superfície	área de superfície	A contagem de células	meios de comunicação	Volume (media)
Placa de 10 cm	52,7 cm 2	1 x 10 6	BEGM	10 ml
filtro de 12 milímetros	1,13 cm 2	2 x 10 5	BEGM	400 ul
filtro de 24 milímetros	4.52 cm 2	8 x 10 5	BEGM	800 ul

Tabela 2: Meios extrapolações por contagem de células.

5. Usando uma multiplicidade de infecção fator (MOI) de 4, adicionar o volume apropriado de vírus à suspensão de células.
6. Adiciona-se brometo de hexadimetrina a um / ml de concentração final de 2 ug.
7. Dispense 400 ul da mistura (BEGM, HBE células, vírus e brometo Hexadimetrina) por inserção de suporte permeável no compartimento apical, e adicionar 1 ml de BEGM sozinho para o compartimento basolateral. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% CO _2. Células Sempre placa HBE sem vírus como controle e seleção de teste puromicina se for o caso.
8. No dia seguinte, REMmídia apical e basolateral ove, lavar com PBS, e substituir os dois compartimentos com interface ar-líquido (ALI) media ^8.
9. Quando as células estão confluentes, remover o líquido apical (conhecido como o estabelecimento de uma interface ar-líquido). Continuar a alterar o meio (ALI) no compartimento de fundo a cada dois dias até atingirem a maturidade plena; geralmente de 3 a 4 semanas mais tarde.
   Nota: Se o vector lentiviral que contém um gene de selecção tal como a puromicina, as células podem ser seleccionadas através da adição de puromicina de acordo com uma curva de concentração de selecção. Para as células HBE, uma concentração de 1 ug / ml foi determinado a ser ideal para a selecção de células transduzidas consistente. No entanto, esta concentração pode ser diferente para outras células ou condições e deve ser determinada por curvas de matar. A adição de puromicina pode começar tão cedo quanto um dia depois de os meios de comunicação foi substituída pela mídia ALI ou posteriores (2-3 dias) para permitir a plena expressão do gene de selecção. Certifique-se de adicionar puromicina a uma inserção que hcomo não foram transduzidas. Puromicina pode ser adicionado até que as células são totalmente diferenciadas.

Resultados

A Figura 1 ilustra diferentes passos chave de avaliar células e soluções durante o processo de transfecção. A Figura 1A mostra a confluência óptimo das células HEK293T antes da transfecção para a produção de vírus. É importante que as células são distribuídos uniformemente ao longo do prato. Figura 1b revela o precipitado em uma gota da mistura de transfecção utilizando brilhantes óptica de campo e uma objectiva 10X. ...

Discussão

O protocolo aqui descrito assegura perto de 100% de eficiência de transdução. No entanto, existem passos durante o processo, que são importantes para alcançar este objectivo. Por exemplo, durante o processo de transfecção, a presença de precipitados na mistura de transdução (gota) ou no prato do dia após a transdução (Figuras 1b e d) são ambos relevantes para uma boa transfecção. A ausência de um precipitado ou a presença de aglomerados pode ser devido a uma omissão d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA