Оптимальное Лентивирус производства и клеточной культуры условия, необходимые для успешного трансдукции Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки

Резюме

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Аннотация

В пробирке культуре первичных бронхиального эпителия (HBE) клеток человека с использованием условий радиоинтерфейса-жидкость обеспечивает полезную модель для изучения процессов дифференцировки и функции клеток в дыхательных путях. За последние несколько лет, использование лентивирусов векторов для доставки трансгенной стала обычной практикой. Хотя имеются сообщения о трансдукции полностью дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей с некоторыми не связанными с ВИЧ псевдо-набран лентивирусах, общая эффективность трансдукции, как правило, менее 15%. Протокол, представленные здесь, обеспечивает надежный и эффективный способ получения лентивирусов и трансдуцировать первичных бронхиальных эпителиальных клеток. Использование недифференцированные бронхиальных эпителиальных клеток, трансдукции в бронхиальных эпителиальных среде для роста, в то время как клетки придают, с кратностью фактора инфекционного 4 обеспечивает эффективность близко к 100%. Этот протокол описывает, шаг за шагом, подготовки и концентрации векторов лентивирусов с высоким титром и гое процесс трансдукции. В нем рассматриваются эксперименты, которые определены оптимальные условия культивирования для достижения высокоэффективных первичных каскадов, бронхиальных эпителиальных клеток человека.

Введение

Развитие репликации исправный, pseudotyped лентивирусах (LV) предоставила исследователям безопасный и эффективный метод для доставки трансгенов в пробирке ^1. Из - за их долговременной экспрессии, эти LV также могут быть использованы для доставки терапевтических агентов в естественных условиях ^2,3. Производство РН требует Котрансфекция эмбриональной почки человека (НЕК) клеток с несколькими плазмид: вектор переноса, упаковки кляп / Pol, упаковки оборот, и конверт вируса везикулярного стоматита (VSV гликопротеин-G) плазмид. Упаковочные системы третьего поколения считаются более безопасными , чем системы второго поколения , так как ген Rev кодируется на отдельной упаковочной плазмиды, тем самым уменьшая возможность рекомбинации , чтобы произвести к репликации лентивирус. Хотя упаковочные системы второго поколения дают пять раз выше, общее количество единиц трансдукции, раскол исходного вирусного генома, чтобы создатьсистема третьего поколения уменьшился уровень трансдукции только минимально ^3,4.

В то время как клеточные линии могут быть трансдуцированных более легко и эффективно, исследователи сосредоточили свое внимание на первичные клетки, поскольку они являются более репрезентативными в естественных тканей ^5,6. Однако первичные клетки невосприимчивыми к трансдукции. В то время как трансдукция полностью дифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей сообщалось, общая эффективность не превышает 15% ^7.

Описанный здесь протокол, который позволяет производить с высоким титром LVs. Подход шаг за шагом излагается достичь почти 100% эффективности трансдукции в первичные клетки HBe. Более конкретно, протокол описывает оптимальные условия культивирования инструментальными для успеха ^3. В кратком изложении, клетки 293Т НЕК трансфицируют с использованием лентивирусов вектора экспрессии PCDH с промотором стимулировать экспрессию EF-1 усиленного зеленого флуоресцентногобелка (EGFP) или mCherry, красный флуоресцентный белок, а также систему упаковки третьего поколения. LVs, выбрасываемых в СМИ собирают от 24 до 72 ч позже. Вирусные частицы концентрируются с полиэтиленгликолем (ПЭГ), удобный и простой метод концентрации вируса, прежде чем оценить титром с использованием набора антигена р24 твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Впоследствии недифференцированная первичные клетки HBE трансдуцируют в средах пролиферации (бронхиальные эпителиальные среде роста или BEGM) ^8, в то время как имеется (после того , как трипсином), при множественности инфекции (MOI) в 4 раза, добавляя бромид hexadimethrine и инкубирование в течение 16 ч ( с ночевкой). Клетки затем дают возможность дифференцировать. Так как вирусный трансген экспрессируется в долгосрочной перспективе (с использованием соответствующего промотора, обсуждение см), выражение будет поддерживаться во время дифференцировки в псевдомногослойный эпителии дыхательных путей или могут быть вызваны (используя индуцируемый промотор) после дифференцировки.

Этот протокол представляет широкий интерес для исследователей, которые хотят использовать первичные клетки HBe вместо клеточных линий, и может быть адаптированы к другим трудно трансдукции типов клеток.

протокол

1. Этап 1: Культура НЕК 293T

1. Готовят НЕК клетки печати (называемые также НЕК СМИ) добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1% (об / об) пенициллина / стрептомицина с высоким содержанием глюкозы Дульбекко Модифицированный Орлиное Medium (DMEM),.
2. Смазать один 10 см блюдо культуры ткани с коллагеном I. Смешайте 30 мкл коллагена I в 2 мл дистиллированной воды. Распространение смесь на блюдо и инкубировать в течение 2 ч при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
3. Удалите смесь и дайте блюду Сушат в шкафу с ламинарным потоком в течение 15 мин.
4. Пластина НЕК клеток на чашке с нанесенным покрытием при плотности 1 х 10 ⁶ клеток в 10 мл НЕК сред и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
5. Когда НЕК клетки 50-60% сплошности (рис 1а, через 2-3 дня после посева), переходите к этапу 2. Визуальная оценка сплошности достаточно. Ни один Количественное не требуется.
   Примечание: НЕК клетки культивируют в НЕК средах (смотри выше). Когда они достигают слитности, тэй могут быть разделены (например , 1/5) , или замораживают для последующего использования.

2. Стадия 2: Производство и концентрация Лентивирусов (LVS) в НЕК клетках

Примечание: Протоколы должны быть выполнены в соответствии с институциональными и правительственными правилами в соответствии с BSL-2 + (расширенная BSL-2) условия в США.

1. Трансфекцию с использованием процедуры осаждения кальция (липофектамина и других агентов трансфекции не были столь же эффективным, как и процедура осаждения кальция). Использование коммерческого набора для трансфекции, рекомендуется, чтобы гарантировать воспроизводимость, хотя процедура изменяется следующим образом. Доведите все реагенты до комнатной температуры. Это день 0.
2. Для каждого 10 см блюдо из клеток НЕК293, смешать 4,5 мкг оболочки ДНК pMD2-VSVG, 7,5 мкг упаковочного ДНК pMDLg / pRRE, 3,75 мкг ДНК ВКПП-REV, 10 мкг ДНК лентивирусов вектора экспрессии, 86 мкл раствора 2 М кальция , и стерильную воду в центрифужные пробирки объемом 15 мл до конечного объема 700 мкл(Последние два решения можно найти в комплекте коммерческой трансфекция).
3. По каплям, добавьте 700 мкл 2x HEPES-буферном солевом растворе (HBS, предусмотренные в комплекте) трансфекцию в то время как вортексе (в шкафу с ламинарным потоком) и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин (перейдите к шагу 4 во время ожидания).
4. В течение раннего периода инкубации, депозит 5 мкл смеси на слайде. Проверьте капельку под микроскопом с объективом 10Х, сосредоточившись медленно вверх и вниз. Тонкий осадок должен быть виден, подтверждая процесс осаждения фосфата кальция (рис 1b).
5. Остановка осаждения через 30 мин путем добавления 10 мл НЕК клеток СМИ и пипеткой вверх и вниз перемешать.
6. Возьмите блюдо из клеток НЕК из стадии 2.1-2.5, и удалить среду (день 0). Добавьте преципитатный раствора со стадии 2.5 осторожно и медленно вдоль края тарелки.
7. На следующий день (день 1), снимите и выбросьте среду, содержащую осадок и заменить его весIth 10 мл НЕК среды. Проверьте наличие тонкого осадка под микроскопом: он должен быть виден в блюдо в пустых пространствах между клетками (рис 1c и г).
8. На 2-й день, собирают средства массовой информации с помощью шприца, фильтруют через фильтр в шприце с размером пор 0,45 мкм в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 3,8 мл 40% полиэтиленгликоля раствора (ПЭГ). Инверсия 5x, чтобы смешивать и хранить при температуре 4 ° С в течение по меньшей мере 24 ч (в течение ПЭГ осаждаются с образованием, но не более чем на 5 дней), пока все вирусные коллекции являются полными.
9. Повторите шаг 2,8 дни 3 и 4. На 4-й день не заменяют НЕК среды, но обеззараживать с 10% отбеливателя и выбросить блюдо.
10. Центрифуга все трубки сбора (как правило, все коллекции вместе на 5-й день) в 1,650 мкг в течение 20 мин при 4 ° C, чтобы осадить вирус. Удалите и отбросить супернатант, и снова вращаются со скоростью 1,650 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы собрать и удалить любой оставшийся ПЭГ супернатанта.
11. ResusПЭНД гранула из каждой пробирки в 200 мкл бронхиальной эпителиальной ростовой среды (BEGM) без амфотерицина ^8. Бассейн их вместе и аликвоты по 200 мкл. Вирус Хранить при температуре -80 ° C. Алиготе еще 10 мкл для выполнения ВИЧ-1 Gag (p24) антиген ELISA анализа.
12. С помощью коммерческого набора ELISA, выполнить анализ антигена р24 в соответствии с протоколом производителя. Анализ дает оценку вирусного p24 в пг / мл.

3. Этап 3: Культура Первичная HBE Клетки

1. Тарелка HBE клетки в 10 мл BEGM среды (100 мкл амфотерицина В , если проход 0 клетки используются для устранения возможного грибкового заражения) при плотности 1 х 10 ⁶ клеток в коллагена I покрытием 10 см блюдо культуры ткани. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО _2.
2. На следующий день, удалите среду и заменить 10 мл BEGM (100 мкл амфотерицина для прохода 0 клеток) в общей сложности на 4 дня. Возвращение в инкубатор.
3. После 4 днейAYS, используйте только BEGM без амфотерицин B. Изменение СМИ через день.
4. Когда клетки составляют 80-90% сплошности (рис 2а; ~ 7 дней после посева), приступить к трансдукции (обратите внимание на 3.5 для подготовки перед трансдукции). Опять же, визуальная оценка состояния сплошности достаточна. Ни один Количественное не требуется.
5. До трансдукции, пальто проницаемые опорные пластины с раствором коллагена IV разводили 1/10 стерильной дистиллированной водой. Добавьте 200 мкл в каждую вставку и просушить в течение ночи в шкафу с ламинарным потоком.

4. Стадия 4: Трансдукция HBe клеток

1. Удалить вложение , добавляют 3 мл 0,1% трипсина в 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты в фосфатном буферном растворе (ЭДТА / ФБР) и инкубировать 5 мин при 37 ° С и 5% СО _2. Проверьте под микроскопом (10х) объективной, чтобы увидеть, если все клетки отсоединяются. Если нет, вернитесь в инкубатор еще в течение 5 мин.
2. Когда все клетки отделяют, добавляют 3мл соевого ингибитора трипсина (SBTI 1 мг / мл), перемешивают и перенос т в центрифужную пробирку на 15 мл. Гранул клетки центрифугированием при 460 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл BEGM и приступить к подсчету.
4. Клетки Ресуспендируют HBE ( в настоящее время прохождение 1 или P1) в соотношении 2 × 10 ⁵ клеток на одну проницаемой опорной вставки 12 мм в 400 мкл BEGM (смотри таблицу 2). Экстраполировать эти числа, основанные на количестве проницаемых вставках поддержки, которые будут трансдуцированных.

поверхность	Площадь поверхности	Количество клеток	СМИ	Объем (СМИ)
10 см блюдо	52,7 см 2	1 х 10 6	BEGM	10 мл
12 мм фильтр	1.13 см 2	2 х 10 5	BEGM	400 мкл
24 мм фильтр	4,52 см 2	8 х 10 5	BEGM	800 мкл

Таблица 2: Медиа экстраполяция на количество клеток.

5. Использование множественности инфекции (MOI) в 4 раза, добавьте соответствующий объем вируса к клеточной суспензии.
6. Добавить полибрен в / мл конечной концентрации 2 мкг.
7. Разлить 400 мкл смеси (BEGM, HBE клетки, вируса и бромид hexadimethrine) на проницаемой опорной вставки в апикальной отсек, и добавьте 1 мл BEGM в одиночку базолатеральной отсек. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% CO _2. Всегда пластины HBe клеток без вируса в качестве контроля и отбора испытаний пуромицин , если это применимо.
8. На следующий день, бэрOve вершинные и базолатеральных СМИ, промывают PBS, и заменить оба отсека с воздушно-жидкостную интерфейса (ALI) средства массовой информации ^8.
9. Когда клетки сливающийся, удалить верхушечный жидкость (известный как создание интерфейса воздух-жидкость). Продолжить изменение среды (ALI) в нижнем отсеке через день, пока они не достигнут полной зрелости; как правило, от 3 до 4 недель спустя.
   Примечание: Если лентивирусов вектор содержит ген селекции, таких как пуромицин, клетки могут быть выбраны путем добавления пуромицин в соответствии с кривой концентрации отбора. Для клеток HBe, в концентрации 1 мкг / мл было определено, что идеально подходит для последовательного отбора трансдуцированных клеток. Тем не менее, эта концентрация может отличаться для других клеток или условий и должно быть определено путем убийства кривых. Добавление пуромицин может начаться уже через день после того, как носитель был заменен ALI СМИ или позже (2-3 дня), чтобы обеспечить полную экспрессию гена селекции. Не забудьте добавить пуромицин к одной вставке, ча не трансдуцированная. Пуромицин могут быть добавлены до тех пор, пока клетки не будут полностью дифференцированы.

Результаты

На рисунке 1 показаны различные ключевые этапы оценки клеток и решений в процессе трансфекции. На рисунке 1а показана оптимальная слитности из HEK293T клеток до трансфекции для производства вируса. Важно , что клетки равномерно распределены по всему блю...

Обсуждение

Протокол описано здесь обеспечивает почти 100% эффективности трансдукции. Тем не менее, есть шаги в процессе, которые являются важными для достижения этой цели. Например, во время процесса трансфекции, наличие преципитатов в трансдукции смеси (капли) или в чашке на следующий день после т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2 M Calcium solution, 2x HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12 mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2 mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA