Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

Özet

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Özet

Hava yolu hücre farklılaşması ve fonksiyon işlemlerini incelemek için yararlı bir model hava-sıvı arayüzü koşulları sağlar kullanılarak primer insan bronş epitel (HBE) hücrelerin in vitro kültüründe. Son birkaç yıl içinde, transgen teslimat için lentiviral vektörleri kullanımı yaygın bir uygulama haline gelmiştir. belli olmayan HIV sözde yazılan Lentivirüslerden tamamen farklılaşmış solunum yolu epitel hücreleri iletimi raporlar varken, genel transdüksiyon verimliliği genellikle% 15'den az olduğunu. Burada sunulan protokol güvenilir ve etkili bir metot lentivirüsler üretmek ve primer insan bronş epitel hücreleri nakletmek için içerir. Hücreler takmak da 4 enfeksiyonun faktörü bir çoğu ile, farklılaşmamış bronşiyal epitel hücreleri, bronşiyal epitel büyüme ortamında transdüksiyonunu kullanılarak% 100'e yakın verimlilik sağlar. Bu protokol, adım-adım, yüksek titre lentiviral vektörler ve th hazırlanması ve konsantrasyon açıklare transdüksiyon süreci. Bu primer insan bronş epitel hücrelerinin yüksek verimli transductions elde etmek için uygun kültür koşulları tespit deneyleri anlatılır.

Giriş

Replikasyon-kusurlu, pseudotyped Lentivirüslerden gelişimi (LV) in vitro ¹ transgenlerin sunmak için güvenli ve etkin bir yöntemle araştırmacılar sağlamıştır. Nedeniyle uzun vadeli ifade, bu AG, aynı zamanda, in vivo ^2,3 terapötik maddelerin uygulanması için de kullanılabilir. LV üretimi birçok plazmid ile insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinin ko-transfeksiyon için gereken: transfer vektörü, ambalaj gag / pol, ambalaj rev ve veziküler stomatit virüsü glikoproteini (VSV-G) plazmidler zarf. REV geni, böylece bir replikasyon yetkili lentivirüs üretilmesi için rekombinasyon olasılığını azaltarak ayrı bir ambalaj plasmid üzerinde kodlandığı için üçüncü nesil paketleme sistemleri ikinci kuşak sistemler daha güvenli olarak kabul edilir. İkinci nesil ambalaj sistemleri beş kat daha fazla toplam iletim üniteleri verim rağmen, orijinal viral genomun bölünmüş oluşturmak içinÜçüncü nesil sistem sadece minimal ^3,4 transdüksiyon seviyesini azalmıştır.

Hücre hatları daha kolay ve verimli bir transduced edilebilir olsa da, bu in vivo daha iyi temsil ^5,6 dokular, çünkü, araştırmacılar, birincil hücreler kendi yoğunlaştırdığını var. Bununla birlikte, birincil hücreler transdüksiyona dirençli bulunmaktadır. Farklılaşmış hava yolu epitel hücrelerinin transdüksiyonu rapor edilmiş olmasına rağmen, genel verimlilik% 15 ⁷ aşmamıştır.

yüksek titre LVS üretimine olanak sağlayan bir protokol aşağıda tarif edilmiştir. Bir adım-adım yaklaşımı birincil HBE hücrelerine neredeyse% 100 transdüksiyon verim elde etmek için belirtilmiştir. Daha spesifik olarak, protokol ³ başarılı olmak için enstrümantal optimum kültür koşullarını tanımlamaktadır. Kısaca HEK 293T hücreleri gelişmiş yeşil floresan EF-1 promotörü tahrik ifade ile lentiviral ifade vektörü pCDH kullanılarak transfekte edilirprotein (EGFP) ya MCherry kırmızı flöresanlı protein ve bir üçüncü nesil ambalajlama sistemi. ortama salınan LVs sonra 24 saat 72 toplanır. Virüs partikülleri, p24 antijen enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak titre tahmin önce, polietilen glikol (PEG), viral konsantrasyona uygun ve kolay bir yöntem ile konsantre edilmiştir. 4 (MOI) bir faktör bir enfeksiyon çokluğunda (tripsinize sonra) takarken sonra, diferansiyasyonlu olmayan primer HBE hücreleri (heksadimetrin bromit ekleme ve 16 saat inkübe, proliferasyon ortam (bronşiyal epitel büyüme ortam ya Begm) ⁸ transdüksiyona bir gecede). Hücreler daha sonra ayırt etmek için izin verilir. Viral transgen (tartışma uygun promotör kullanılarak) uzun vadeli ifade edildiğinden, bu ifade bir yalancı solunum yolu epitelinde farklılaşma boyunca muhafaza edilir veya farklılaşmadan sonra (indüklenebilir bir promotör kullanılarak) indüklenebilir.

Bu protokol hücre hatları yerine birincil HBE hücrelerini kullanmak istediğiniz araştırmacıların geniş ilgi ve hücre tiplerini transduce diğer zor adapte olabilir.

Protokol

1. Aşama 1: HEK 293T Kültür

1. Yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin eklenmesi ile (HEK ortam olarak adlandırılır) HEK hücreleri ortamı hazırlar.
2. Kat kollajen, kollajen I Çeşitli 30 ul bir damıtılmış su ve 2 ml bir kez 10 cm doku kültürü çanağı. Tabak üzerine yayıldı karışımı 37 ° C de 2 saat ve% 5 _CO2 inkübe edilir.
3. karışımı çıkarın ve 15 dakika boyunca bir laminer akış kabini bulaşık kurumaya bırakın.
4. 10 mi HEK ortamında 1 x 10 ⁶ hücre yoğunluğunda kaplanmıştır tabağa levhalar HEK hücreleri 37 ° C 'de inkübe etmek ve% 5 _CO2.
5. HEK hücreleri (2-3 gün sonra kaplama Şekil 1a)% 50-60 konfluent olduğunda, confluency 2. Görsel değerlendirme yeterlidir sahneye geçin. Hiçbir ölçümü gereklidir.
   Not: HEK hücreleri (yukarıya bakın) HEK ortamda kültürlenir. Onlar confluency ulaşmak, they bölünmüş (örneğin 1/5) ya da daha sonra kullanılmak üzere aşağı dondurulabilir.

2. Aşama 2: HEK Hücreleri Üretimi ve Lentiviruses (karaciğer hacimleri) Yoğunlaşma

Not: protokolleri BSL-2 ABD'de + (gelişmiş BSL-2) koşullar altında kurumsal ve hükümet düzenlemelerine uygun olarak yürütülmelidir.

1. Bir kalsiyum çökeltme prosedürü kullanarak Transfect (lipofektamin ve diğer transfeksiyon ajanları kalsiyum yağış prosedürü kadar verimli değildi). Prosedür aşağıdaki gibi tadil edilmiş olmasına rağmen, ticari bir transfeksiyon kiti kullanılarak yeniden üretilebilirliğinin temini için tavsiye edilir. Oda sıcaklığına Tüm reaktifler getirin. Bu gün 0'dır.
2. HEK293 hücrelerinin her 10 cm tabak için, zarf DNA, pMD2-VSVG 4.5 ug, 7.5 ug DNA, pMDLg / pRRE ambalajlar, 3.75 ug DNA, pRSV-rev, lentiviral sentezleme vektörünün 10 ug DNA, 2 M, kalsiyum çözeltisinin 86 ul karıştırın ve 700 ul son hacim olması için 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne steril su(Bu sonraki iki çözüm, ticari transfeksiyon kiti temin edilmiştir).
3. Bilge-Drop (transfeksiyon kitinde HBS) 2x HEPES tamponlu tuz 700 ul (laminer akış kabini içinde) vorteks ederken eklemek ve 30 dakika (beklerken adım 4 gerçekleştirin) oda sıcaklığında kuluçkaya yatmaktadır.
4. Erken inkübasyon süresi boyunca, bir slayt karışımı mevduat 5 ul. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı odaklanarak, 10X amacı ile mikroskop altında damlacık kontrol edin. İnce bir çökelti, kalsiyum fosfat çökeltme işlemi teyit görünür olmalıdır (Şekil 1b).
5. karıştırmak için yukarı ve aşağı HEK hücreleri medya ve pipet 10 ml ilave edilerek 30 dakika sonra çökelmesini durdurun.
6. Adım 2,1-2,5 den HEK hücrelerinin çanak alın ve orta (gün 0) çıkarın. yemeğin kenarından dikkatlice ve yavaşça adım 2.5 den çökelti çözüm ekleyin.
7. Ertesi gün (gün 1) Açık, kaldırmak ve çökelti içeren orta atmak ve w yerineHEK ortamının i 10 mi. Mikroskop altında ince çökelti olup olmadığını kontrol edin: Bu hücreler (Şekil 1c ve d) arasındaki boş alanlarda tabağına görünür olmalıdır.
8. 2. günde,% 40 polietilen glikol, 3.8 mi (PEG) çözeltisi ihtiva eden 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, bir 0.45 um şırınga filtre ile bir şırınga filtresi ile ortam toplama. (PEG oluşturmak üzere çökeltilmesi, ancak 5 günden fazla için) virüsü koleksiyonları tüm tamamlanıncaya kadar Ters 5x en az 24 saat süre ile 4 ° C'de karıştırın ve saklamak için.
9. gün 3 ve 4. günde 4. adımı yineleyin 2.8 HEK orta ile değiştirin ama% 10 çamaşır suyu ile temizleyin ve çanak atmayın.
10. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1,650 x g'de santrifüjleyin tüm toplama tüpleri (birlikte, 5. günde genellikle tüm toplama) virüsü peletine. Süpernatantı çıkarın ve atın ve toplamak ve herhangi bir PEG süpernatant kalan çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 xg'de tekrar dönerler.
11. Resuspend amfoterisin B ⁸ olmayan bronşiyal epitel büyüme ortam (Begm) 200 ul her bir tüp pelet. araya havuzuna ve 200 ul tümbölen. -80 ° C'de saklayın virüsü. HIV-1 Gag (P24) antijen ELISA deneyi gerçekleştirmek için ilave bir 10 ul tablet.
12. ticari bir ELISA kiti kullanılarak üreticinin protokolüne göre, bir p24 antijen tahlilini gerçekleştirmek. Tahlil pg / ml viral p24 bir tahmin verir.

3. Aşama 3: Kültür İlköğretim HBE Hücreler

1. 10 mi Begm ortam Plaka HBE hücreleri I 10 cm doku kültürü çanağı kaplanmış bir kolajen 1 x 10 ⁶ hücre yoğunluğunda (100 ul amfoterisin B kanalı 0 hücreleri mümkün fungal kirlenmeyi elimine etmek için kullanılması durumunda). 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 _CO2.
2. Bir sonraki gün, ortam çıkarın ve 4 günlük bir toplam (geçişi için 100 ul amfoterisin B 0 hücreleri) 10 mi Begm ile değiştirin. inkübatör dönmek.
3. 4 Gün sonraays, her geçen gün amfoterisin B Değişim medya olmadan sadece Begm kullanın.
4. Hücreler% 80-90 ortak akışlı (Şekil 2a; ~ 7 gün sonra kaplama) olduğunda, transdüksiyon devam (transdüksiyon öncesi hazırlık için 3.5 dikkat). Yine, konfluent görsel değerlendirmesi yeterlidir. Hiçbir ölçümü gereklidir.
5. transdüksiyon önce, ceket kolajen IV çözeltisi ile geçirgen destek uçlar steril damıtılmış su ile 1/10 seyreltilmiştir. Her ekleme 200 ul ekleyin ve laminer akış kabini kuru gecede izin verin.

4. Aşama 4: HBE Hücreler İletimi

1. Ortamı çıkarın fosfat tamponlu tuzlu su (EDTA / PBS) içinde 1 mM etilendiamintetraasetik asit,% 0.1 tripsin 3 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 5 dakika ve% 5 _CO2 inkübe edin. tüm hücreleri müstakil olup olmadığını görmek için mikroskop (10X objektif) altında kontrol edin. Aksi takdirde, ilave bir 5 dakika boyunca inkübatör dönmek.
2. tüm hücreleri müstakil zaman, 3 eklemeksoya fasulyesi tripsin inhibitörü mi (SBTI 1 mg / ml) karışımı ve 15 ml santrifüj tüpüne transfer. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 460 x g'de iplik hücreleri Pelet.
3. Begm 3 ml içine süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın ve sayma işlemine devam edin.
4. Begm 400 ul (bakınız Tablo 2) 'de, bir 12 mm geçirgen destek uç başına 2 x 10 ⁵ hücre oranında yeniden süspanse HBE hücreler (şimdi kanalı 1 ya da P1). transduced edilecek geçirgen destek ekler miktarına göre bu sayıları tahmin.

Yüzey	Yüzey alanı	Hücre sayımı	medya	Hacim (medya)
10 cm çanak	52.7 cm2	1 x 10 6	begm	10 mi
12 mm filtre	1.13 cm2	2 x 10 5	begm	400 ul
24 mm filtre	4.52 cm2	8 x 10 5	begm	800 ul

Tablo 2: hücre sayımı başına Medya sınırlandırmaktadır.

5. 4 enfeksiyon (MOI) faktörünün çok sayıda kullanılarak, hücre süspansiyonunun virüsün uygun hacimde ekleyin.
6. 2 ug / ml nihai konsantrasyona heksadimetrin bromit ekleyin.
7. apikal bölmeye geçirgen destek insert başına mix (Begm, HBE hücreleri, virüs ve hexadimethrine bromür) 400 ul koyun ve bazolateral bölmeye tek başına Begm 1 ml ekleyin. Kontrol ve test puromisin seçimi varsa da virüs olmadan 37 ° C ve% 5 CO _2. Her zaman plaka HBE hücreleri gecede inkübe.
8. Ertesi gün, rem üzerindeove en üst ve taban ortamı, PBS ile yıkayın ve hava-sıvı arayüzü (ALI), medya ⁸ her iki bölümü değiştirin.
9. Hücreler birleştiklerinde, ne olursa olsun, (bir hava-su ara-yüzünün kurulması olarak da bilinir), apikal sıvıyı. onlar tam olgunluğa ulaşana kadar alt bölmeye her gün de orta (ALI) değişen devam edin; genellikle 3 ila 4 hafta sonra.
   Not: lentiviral vektör, puromisin gibi bir seçim genini ihtiva ise hücreler bir seçme konsantrasyonu eğrisine göre puromisin eklenerek seçilebilir. HBE hücreleri için, 1 ug / ml bir konsantrasyon kalıt aktarımlı hücrelerin istikrarlı seçimi için ideal olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, bu konsantrasyon diğer hücrelere veya koşullar için farklı olabilir ve eğrileri öldürerek belirlenmelidir. Medya seçimi geninin tam ifadesini izin sonrası ALI medya ya da (2-3 gün) tarafından değiştirildikten sonra puromycin ilavesi gibi erken bir sürede güne başlayabilirsiniz. bir parçanın bu h puromisin eklemek için emin olunolarak transduced edilmemiştir. Hücreler tamamen farklılaşmış kadar puromycin eklenebilir.

Sonuçlar

Şekil 1 1a Şekil. Transfeksiyon sürecinde hücreleri ve çözümleri değerlendirmek farklı anahtar adımları göstermektedir önce virüs üretimi için transfeksiyon için HEK293T hücrelerinin optimum confluency gösterir. Hücreler çanak boyunca eşit olarak dağıtılmış olması önemlidir. 1b parlak bir alan optik ve 10X objektif kullanılarak transfeksiyon karışımı bir damla çökelti ortaya Şekil. Da...

Tartışmalar

Burada özetlenen protokol% 100 iletim verimliliği yakın sağlar. Bununla birlikte, bu hedefe ulaşmak için önemli olan işlem sırasında adım vardır. Örneğin, transfeksiyon işlemi sırasında, transdüksiyon karışımı çökeltilerin varlığı (damla) veya çanak transdüksiyon (Şekil 1b ve d) gün sonra iyi bir transfeksiyon için uygun hem de. bir çökelti ya da topakların bulunması olmaması transfeksiyon reaktifleri birinin bir eksiklik, bir pH sorun, ya da kötü ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA