正常に伝達する初代ヒト気管支上皮細胞に必要な最適なレンチウイルスの生産および細胞培養条件

要約

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

要約

初代ヒト気管支上皮（HBE）細胞のインビトロ培養で気液界面条件を用いて気道細胞の分化と機能の過程を研究するための有用なモデルを提供します。過去数年間で、導入遺伝子の送達のためのレンチウイルスベクターの使用は、一般的な慣行となりました。特定の非HIV擬似型付けされたレンチウイルスと完全に分化した気道上皮細胞の形質導入の報告がありますが、全体的な形質導入効率は、通常15％未満です。ここで紹介するプロトコルは、レンチウイルスを生成すると、一次ヒト気管支上皮細胞を形質導入するために信頼性の高い効率的な方法を提供します。細胞が付着しながら4の感染因子の多重度で、未分化の気管支上皮細胞、気管支上皮増殖培地で形質導入を使用すると、100％に近い効率を提供します。このプロトコルは、高力価のレンチウイルスベクターの、ステップ・バイ・ステップ、準備と集中を説明し、第電子伝達プロセス。これは、初代ヒト気管支上皮細胞の高効率形質導入を達成するために最適な培養条件を決定した実験について説明します。

概要

複製欠損、偽レンチウイルス（LV）の開発は、 インビトロ ¹ で導入遺伝子を提供するために、安全かつ効率的な方法で研究者に提供してきました。それらの長期発現のために、これらのLVはまた、 インビボ ^2,3 における治療剤の送達のために使用することができます。トランスファーベクター、パッケージングのgag / POL、パッケージ回転 、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）プラスミドエンベロープ：LVの製造は、いくつかのプラスミドを有するヒト胚腎臓（HEK）細胞の同時トランスフェクションを必要とします。 rev遺伝子は、別々のパッケージングプラスミド上にコードされているため、第三世代のパッケージングシステムは、それによって複製コンピテントレンチウイルスを生成するための組換えの可能性を低減する、第二世代のシステムよりも安全と考えられています。第二世代のパッケージングシステムが5倍高い総伝達ユニットを得ているが、元のウイルスゲノムの分割が作成します第三世代のシステムは、最小限^3,4形質導入のレベルを減少しました。

細胞株は、より容易かつ効率的に形質導入することができるが、これらは、 インビボの組織^5,6のより代表的なものであるため、研究者らは、一次細胞へのフォーカスをシフトしています。しかし、初代細胞は、形質導入に不応性です。完全に分化した気道上皮細胞の形質導入が報告されているが、全体の効率は^15％7を超え^ていません。

ここで説明した高力価のLVの製造を可能にするプロトコルです。ステップバイステップのアプローチは、一次HBE細胞中にほぼ100％の形質導入効率を達成するために概説されています。具体的には、プロトコルは^、3を成功するために尽力し、最適な培養条件を説明します。簡単に言えば、HEK 293T細胞を、強化緑色蛍光のEF-1プロモーター駆動発現を有するレンチウイルス発現ベクターpCDHを用いてトランスフェクションされていますタンパク質（EGFP）またはmCherryを、赤色蛍光タンパク質、および第三世代のパッケージングシステム。培地中に放出されたLVは24〜72時間後に回収されています。ウイルス粒子は、p24抗原の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットを用いて力価を推定する前に、ポリエチレングリコール（PEG）、ウイルス濃度の便利で簡単な方法で濃縮されています。 、4の（トリプシン処理された後）、感染の多重度（MOI）因子を取り付けるヘキサジメトリンブロミドを添加し、16時間インキュベートしながら、その後、未分化の一次HBE細胞（増殖培地（気管支上皮成長培地または^BEGM）8で形質導入され一晩）。次いで、細胞を分化させます。ウイルス導入遺伝子は（説明を参照してください、適切なプロモーターを用いて）、長期発現されるので、式は多列気道上皮への分化を通して維持されますまたは分化後（誘導性プロモーターを使用して）誘導することができます。

このプロトコルは、細胞株の代わりに、一次HBE細胞を使用する研究者への幅広い関心のある、および細胞型を形質導入する他の困難に適応できる可能性があります。

プロトコル

1.ステージ1：HEK 293Tの文化

1. 高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより（HEK媒体という）HEK細胞の培地を調製します。
2. コー​​トコラーゲンのコラーゲンI.ミックス30μlの私の蒸留水2ml中で1 10cmの組織培養皿。皿にミックスを広げ、37℃で2時間、5％CO ₂インキュベートします。
3. ミックスを削除し、15分間クリーンベンチ内の食器乾燥させます。
4. 10ミリリットル中に1×10 ⁶細胞の密度HEKメディアでコーティングされたディッシュ上にプレートHEK細胞と、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。
5. HEK細胞50〜60％コンフルエント（ 図1a、メッキ後2-3日）である場合、密集度の2視覚的評価が十分にあるステージに進みます。いいえ定量化は必要ありません。
   注：HEK細胞（上記参照）HEK培地中で培養されます。彼らはコンフルエントに達し、トンちょっと分割（ 例えば 1/5）以降の使用のためにダウンして凍結することができます。

2.ステージ2：HEK細胞でのレンチウイルス（LVの）の生産と集中

注：プロトコルは、BSL-2 USAで+（拡張BSL-2）の条件で、制度や政府の規制に沿って実行する必要があります。

1. カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクト（リポフェクタミンおよび他のトランスフェクション剤がカルシウム沈殿法ほど効率的ではなかったです）。次のように手順が変更されたものの商業トランスフェクションキットの使用は、再現性を確保することをお勧めします。室温にすべての試薬を持参。これは、0日目です。
2. HEK293細胞のそれぞれ10cmディッシュの場合は、エンベロープDNA PMD2-VSVGの4.5μgの、7.5μgのDNA pMDLg / pRREを包装、3.75μgのDNAのpRSV-REV、レンチウイルス発現ベクター10μgのDNA、2 Mカルシウム溶液の86μLを混ぜます700μlの最終容量に15mLの遠心管中に、滅菌水（後者の二つの溶液を、市販のトランスフェクションキットで提供されています）。
3. （待っている間、ステップ4を実行）、賢明なドロップボルテックスしながら（クリーンベンチ内で）（トランスフェクションキットで提供さHBS）2×HEPES緩衝生理食塩水の700μlを添加し、30分間室温でインキュベートします。
4. 初期のインキュベーション時間の間に、スライド上のミックスの堆積物5μlの。ゆっくりと上下に焦点を当て、10倍の対物レンズと顕微鏡下での液滴を確認してください。微細な沈殿物が、リン酸カルシウム沈殿法を確認し、可視であるべきである（ 図1B）。
5. 混合するために上下HEK細胞メディアやピペットの10ミリリットルを追加することにより、30分後、沈殿を停止します。
6. ステップ2.1から2.5からHEK細胞の皿を取り、そして培地（0日目）を削除します。皿の縁に沿って慎重にゆっくりとステップ2.5からの沈殿物の溶液を加えます。
7. 次の日（1日目）には、削除して、沈殿物を含む培地を破棄し、wはそれを置き換えますHEK媒体のi番目の10ミリリットル。顕微鏡下で微細な沈殿を確認してください：それは、細胞（ 図1cとd）の間の空きスペースに皿に表示されるはずです。
8. 2日目に、シリンジを用いて40％のポリエチレングリコール（PEG）溶液3.8 mlを含有する15mLの遠心管に0.45μmのシリンジフィルターを通してフィルター媒体を集めます。ウイルスコレクションのすべてが完了するまで反転5Xは、（PEGを形成するために、沈殿したが、もはや5日以上の場合）、少なくとも24時間、4℃で混合し、ストアします。
9. 4日目3日目と4上の手順を繰り返し2.8は、HEK培地と交換したが、10％の漂白剤で除染し、皿を破棄することはありません。
10. 遠心分離機すべてのコレクションチューブ（通常は5日目に一緒にすべてのコレクション）4℃で20分間、1650×gでは、ウイルスをペレット化します。削除し、上清を捨て、そして収集し、任意のPEG上清の残りを除去するために、4℃で5分間、1650×gで再びスピン。
11. Resus保留アムホテリシンB ⁸なし気管支上皮成長培地（BEGM）の200μl中各管のペレット。それらを一緒にプールし、200μlにアリコート。 -80℃で保存ウイルス。 HIV-1のGag（P24）抗原ELISAアッセイを実行するために追加の10μLを分注し。
12. 市販のELISAキットを用い、製造業者のプロトコルに従ってp24抗原アッセイを行います。アッセイは、pg / mlで中のウイルスのp24の推定を与えます。

3.ステージ3：文化初代HBE細胞

1. 10 mlのBEGM培地でプレートHBE細胞はIを10cm組織培養皿コーティングされたコラーゲンで1×10 ⁶細胞の密度で（100μlのアムホテリシンBで継代0細胞は、可能な真菌の汚染を除去するために使用される場合）。 37℃で培養し、5％CO _2。
2. 翌日、培地を除去し、4日間の合計（継代0細胞のための100μlのアムホテリシンBを含む）10ミリリットルBEGMと交換してください。インキュベーターに戻します。
3. 4日後にAYS、一日おきにアムホテリシンBを変更メディアなしのみBEGMを使用します。
4. 細胞が80〜90％のコンフルエント（ 図2a;〜7日めっき後）である場合には、形質導入を進める（形質導入前の準備のために3.5に注意を払います）。再び、密集度の視覚的評価で十分です。いいえ定量化は必要ありません。
5. 形質導入の前に、コートコラーゲンIV溶液で透過性支持体の挿入は、無菌蒸留水で1/10に希釈しました。各インサートに200μlを添加して、クリーンベンチ内で一晩乾燥してみましょう。

4.ステージ4：HBE細胞の形質導入

1. 、メディアを削除するリン酸緩衝生理食塩水（EDTA / PBS）中に1mMのエチレンジアミン四酢酸中の0.1％トリプシンを3mlを添加し、37℃、5％CO ₂で5分間インキュベートします。すべてのセルが切り離されているかどうかを確認するために、顕微鏡（10倍対物レンズ）の下で確認してください。ない場合は、さらに5分間インキュベーターに戻します。
2. 全ての細胞が分離されている場合、3を追加大豆トリプシンインヒビターのミリリットル（SBTIを1mg / ml）を、混合し、15mlの遠心管に移します。室温で5分間、460×gで回転させて細胞をペレット。
3. BEGMの3ミリリットルに上清および再懸濁ペレットを削除して、カウントを進めます。
4. BEGM400μlの（ 表2参照）内の1つの12ミリメートルの透過性支持体インサートあたり2×10 ⁵細胞の割合で再懸濁HBE細胞（今継代1またはP1）。形質導入される透過性支持体インサートの量に基づいて、これらの数値を推定。

表面	表面積	細胞計数	メディア	ボリューム（メディア）
10cmディッシュ	cm 2の52.7	1×10 6	BEGM	10ミリリットル
12ミリメートルフィルター	1.13センチメートル2	2×10 5	BEGM	400μlの
た24mmフィルター	4.52センチメートル2	8×10 5	BEGM	800μlの

表2：細胞数あたりのメディアの外挿。

5. 4の感染（MOI）因子の多重度を使用して、細胞懸濁液にウイルスの適切な量を追加します。
6. 2 / mlの最終濃度に臭化ヘキサジメトリンを追加します。
7. 先端区画に挿入透過性支持体あたりのミックス（BEGM、HBE細胞、ウイルスおよび臭化ヘキサジメトリン）の400μLを分注し、および側底コンパートメントに単独BEGMの1ミリリットルを追加します。該当する場合は、必ずコントロールおよび試験ピューロマイシン選択としてウイルスなしHBE細胞をプレート37℃で一晩インキュベートし、5％CO _2。
8. 翌日、レムオベ頂端および側底メディアは、PBSで洗浄し、気液界面（ALI）メディア⁸との両方の区画を交換してください。
9. 細胞がコンフルエントである場合、（気液界面を確立するとして知られている）頂端流体を除去。彼らは完全な成熟に達するまで、ボトムコンパートメント日おきに培地（ALI）を変更し続けます。通常3〜4週間後。
   注：レンチウイルスベクターは、ピューロマイシンのような選択遺伝子が含まれている場合、細胞は、選択濃度曲線に従ってピューロマイシンを添加することによって選択することができます。 HBE細胞は、を1μg/ mlの濃度で形質導入した細胞の一貫した選択するための理想的であることが決定されています。しかし、この濃度は、他の細胞または条件ごとに異なる​​可能性があり、カーブを殺すことによって決定されるべきです。ピューロマイシンの添加は、メディアが選択遺伝子の完全な発現を可能にするALIメディアまたはそれ以降（2-3日）に置き換えられました後、早ければ1日として開始することができます。その時間1インサートにピューロマイシンを追加してください形質導入されていません。細胞が完全に分化されるまで、ピューロマイシンを添加することができます。

結果

図1は、トランスフェクションプロセス中に細胞およびソリューションを評価する別の重要なステップを示している。 図1aは、従来のウイルス産生のためのトランスフェクションHEK293T細胞の最適なコンフルエンシーを示します。細胞をシャーレ全体に均等に分配されることが重要である。 図1bは、明視野光学と10倍の対物レンズ?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、100％の形質導入効率に近い保証します。しかし、この目標を達成するために重要な工程中のステップがあります。例えば、トランスフェクションプロセスの間に、日形質導入（ 図1b及びd）の後、形質導入ミックス（ドロップ）または皿の中の析出物の存在は、両方の良いトランスフェクションのために関連しています。沈殿物または?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA