Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell'uomo epiteliali bronchiali

Riepilogo

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Abstract

In coltura in vitro di cellule primarie umane epiteliali bronchiali (HBE) utilizzando condizioni di interfaccia aria-liquido fornisce un modello utile per studiare i processi di differenziazione cellulare delle vie aeree e la funzione. Negli ultimi anni, l'uso di vettori lentivirali per la consegna transgene diventata pratica comune. Mentre ci sono segnalazioni di trasduzione di cellule epiteliali delle vie aeree completamente differenziate con alcuni lentivirus pseudo-digitato non-HIV, l'efficienza complessiva di trasduzione è di solito inferiore al 15%. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per produrre lentivirus e di trasdurre cellule epiteliali bronchiali umane primarie. Usando cellule epiteliali bronchiali indifferenziate, trasduzione in terreni di crescita epiteliale bronchiale, mentre le cellule attaccano, con una molteplicità di infezione di fattore 4 fornisce efficienze vicino al 100%. Questo protocollo descrive, passo dopo passo, la preparazione e la concentrazione di vettori lentivirali alto titolo e esimoprocesso di trasduzione e. Si discute gli esperimenti che hanno determinato le condizioni di coltura ottimali per raggiungere trasduzione altamente efficienti di cellule epiteliali bronchiali umane primarie.

Introduzione

Lo sviluppo di replica-difettose, lentivirus pseudotyped (LV) ha fornito ai ricercatori un metodo sicuro ed efficace per fornire transgeni in vitro ^1. Grazie alla loro espressione a lungo termine, questi LV potrebbe essere utilizzato anche per l'erogazione di agenti terapeutici in vivo ^2,3. La produzione di LV richiede co-trasfezione di rene embrionali umane (HEK) cellule con diversi plasmidi: vettore di trasferimento, imballaggi gag / pol, imballaggi di giri, e la busta vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSV-G) plasmidi. Sistemi di imballaggio di terza generazione sono considerati più sicuri rispetto ai sistemi di seconda generazione perché il gene rev è codificato su un plasmide confezione separata, riducendo così la possibilità di ricombinazione per produrre un lentivirus competente replica. Anche se i sistemi di confezionamento di seconda generazione producono cinque unità di trasduzione totali superiori piega, la scissione del genoma virale originale per creareil sistema di terza generazione ha diminuito il livello di trasduzione solo minimamente ^3,4.

Mentre le linee cellulari possono essere trasdotte più semplice ed efficiente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per le cellule primarie, perché questi sono più rappresentativi di tessuti in vivo ^5,6. Tuttavia, le cellule principali sono refrattari alla trasduzione. Mentre sono stati segnalati trasduzione di cellule delle vie aeree epiteliale completamente differenziate, l'efficienza complessiva non sia superiore al 15% ^7.

Qui descritto è un protocollo che permette la produzione di LV alto titolo. Un approccio step-by-step è delineato per raggiungere quasi il 100% di efficienza di trasduzione in cellule HBE primarie. Più specificamente, il protocollo descrive le condizioni di coltura ottimali strumentali per riuscire ^3. In breve, le cellule 293T HEK sono trasfettate utilizzando il lentivirale pCDH vettore di espressione con il EF-1 promotore di espressione di guida di una maggiore verde fluorescenteproteine ​​(eGFP) o mCherry, una proteina fluorescente rossa, e un sistema di confezionamento di terza generazione. LV rilasciate in media sono raccolti 24-72 ore più tardi. Le particelle virali sono concentrati con polietilene glicole (PEG), un metodo conveniente e facile della concentrazione virale, prima stima titolo utilizzando un kit di p24 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Successivamente, le cellule HBE primarie indifferenziate sono trasdotti in mezzi proliferazione (terreno di crescita epiteliale bronchiale o BEGM) ^8, mentre si collega (dopo essere tripsinizzati), ad una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungendo hexadimethrine bromuro e incubando per 16 ore ( durante la notte). Le cellule sono poi lasciati differenziare. Poiché il transgene è espresso virale a lungo termine (utilizzando il promotore appropriato, vedere la discussione), espressione verrà mantenuta per tutto differenziazione in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato o può essere indotta (utilizzando un promotore inducibile) dopo la differenziazione.

Questo protocollo è di grande interesse per i ricercatori che desiderano utilizzare le cellule HBE primarie, invece di linee cellulari, e potrebbe essere adattabile ad altri difficili da trasdurre tipi di cellule.

Protocollo

1. Fase 1: cultura di HEK 293T

1. Preparare cellule HEK supporti (denominato come HEK media) aggiungendo 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina ad alto glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM).
2. Cappotto uno 10 centimetri piatto di coltura di tessuti con collagene I. Mix 30 ml di collagene I in 2 ml di acqua distillata. Stendere l'impasto sul piatto e incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.
3. Rimuovere la miscela e lasciare asciugare piatto in una cappa a flusso laminare per 15 min.
4. Cellule HEK piastra nel piatto rivestito ad una densità di celle 1 x 10 ⁶ a 10 ml mezzi HEK e incubare a 37 ° C e 5% CO _2.
5. Quando le cellule HEK sono 50-60% confluenti (Figura 1a, 2-3 giorni dopo la placcatura), passare alla fase 2. Valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione.
   Nota: cellule HEK sono coltivate in mezzi HEK (vedi sopra). Quando raggiungono confluenza, they può essere suddiviso (ad esempio 1/5) o congelati verso il basso per un uso successivo.

2. Fase 2: Produzione e la concentrazione di lentivirus (LV) in cellule HEK

Nota: I protocolli devono essere eseguiti in linea con le normative istituzionali e governative in + (Enhanced BSL-2) le condizioni negli Stati Uniti BSL-2.

1. Trasfezione utilizzando una procedura di precipitazione di calcio (Lipofectamine e altri agenti di trasfezione non fosse efficiente come la procedura di precipitazione di calcio). Si consiglia l'uso di un kit trasfezione commerciale per garantire la riproducibilità, anche se la procedura è modificato come segue. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente. Questo è il giorno 0.
2. Per ogni 10 centimetri piatto di cellule HEK293, mescolare 4,5 mg di busta DNA PMD2-VSVG, 7,5 mg il confezionamento di DNA pMDLg / pRRE, 3,75 mg di DNA pRSV-rev, 10 mg di DNA di vettori lentivirali di espressione, di 86 ml di una soluzione 2 M di calcio e acqua sterile in un tubo da centrifuga da 15 ml per un volume finale di 700 microlitri(Questi ultimi due soluzioni vengono forniti nel kit trasfezione commerciale).
3. Goccia a goccia, aggiungere 700 ml di soluzione fisiologica 2x HEPES-buffered (HBS, forniti nel kit trasfezione), mentre vortex (nella cappa a flusso laminare) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti (eseguire il passaggio 4 durante l'attesa).
4. Durante il tempo di incubazione presto, deposito 5 microlitri della miscela su un vetrino. Controllare la goccia sotto un microscopio con un obiettivo 10X, concentrandosi lentamente su e giù. Un bel precipitato deve essere visibile, a conferma del processo di precipitazione di fosfato di calcio (Figura 1b).
5. Fermare la precipitazione dopo 30 minuti con l'aggiunta di 10 ml di HEK cellule media e pipetta su e giù per mescolare.
6. Prendete il piatto di cellule HEK dal passaggio 2,1-2,5, e rimuovere il supporto (giorno 0). Aggiungere la soluzione precipitato dal punto 2.5 attentamente e lentamente lungo il bordo del piatto.
7. Il giorno successivo (giorno 1), rimuovere ed eliminare il supporto contenente il precipitato e sostituirlo wesimo 10 ml di terreno HEK. Controllare per fini precipitato sotto il microscopio: dovrebbe essere visibile nel piatto in spazi vuoti tra le cellule (Figure 1C e d).
8. Il giorno 2, raccogliere media con una siringa, filtro attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 3,8 ml di un glicole polietilene 40% soluzione (PEG). Inverti 5x per mescolare e conservare a 4 ° C per almeno 24 ore (per il PEG precipitare in modo da formare, ma non più di 5 giorni) fino a quando tutte le collezioni di virus sono completi.
9. Ripetere il passaggio 2.8 nei giorni 3 e 4. Il giorno 4 non sostituirli con media HEK ma decontaminare con il 10% di candeggina e scartare il piatto.
10. Centrifugare tutte le provette per la raccolta (in genere tutte le collezioni insieme il giorno 5) a 1.650 xg per 20 minuti a 4 ° C a pellet il virus. Rimuovere e scartare il surnatante, e far girare di nuovo a 1.650 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere e rimuovere ogni residuo di PEG surnatante.
11. Resuspend il pellet di ogni tubo in 200 ml di bronchiale mezzo di crescita epiteliale (BEGM) senza amfotericina B ^8. riunirli e aliquota a 200 ml. virus Conservare a -80 ° C. Aliquota altri 10 ml di eseguire il test Gag di HIV-1 (p24) l'antigene ELISA.
12. Utilizzando un kit commerciale ELISA, eseguire un test dell'antigene p24 secondo il protocollo del produttore. Il test fornisce una stima della p24 virale in pg / ml.

3. Fase 3: cellule di coltura HBE primaria

1. Cellule Piatto HBE in 10 ml BEGM supporti (con 100 microlitri amfotericina B se il passaggio 0 cellule sono utilizzati per eliminare eventuali contaminazioni fungine) ad una densità di celle 1 x 10 ⁶ in collagene I spalmato 10 centimetri piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Il giorno successivo, rimuovere il supporto e sostituire con 10 ml BEGM (con 100 ml amfotericina B per il passaggio 0 cellule) per un totale di 4 giorni. Ritorno a incubatore.
3. Dopo 4 dAYS, utilizzare solo BEGM senza amfotericina B. Cambio media ogni due giorni.
4. Quando le cellule sono 80-90% confluenti (figura 2a; ~ 7 giorni dopo la placcatura), procedere con la trasduzione (prestare attenzione a 3,5 per la preparazione prima trasduzione). Ancora una volta, valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione.
5. Prima di trasduzione, cappotto gli inserti di supporto permeabili con una soluzione di collagene IV diluita 1/10 con acqua distillata sterile. Aggiungere 200 microlitri di ogni inserto e lasciare asciugare per una notte nella cappa a flusso laminare.

4. Fase 4: trasduzione delle cellule HBE

1. Rimuovere supporti, aggiungere 3 ml di 0,1% tripsina in 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico in tampone fosfato isotonico (EDTA / PBS) e incubare 5 min a 37 ° C e 5% CO _2. Controllare al microscopio (obiettivo 10X) per vedere se tutte le celle sono staccati. In caso contrario, tornare alla incubatore per un ulteriore 5 min.
2. Quando tutte le cellule sono staccati, aggiungere 3ml di inibitore della tripsina di soia (SBTI 1 mg / ml), mescolare e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Agglomerare le cellule facendo girare a 460 xg per 5 min a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di BEGM e procedere con il conteggio.
4. Risospendere le cellule HBE (ora di passaggio 1 o P1) in un rapporto di 2 x 10 ⁵ cellule per un inserto di supporto permeabile 12 millimetri in 400 ml di BEGM (vedi tabella 2). Estrapolare questi numeri in base alla quantità di inserti di supporto permeabili che verranno trasdotte.

Superficie	Superficie	conta delle cellule	media	Volume (media)
10 centimetri piatto	52,7 cm 2	1 x 10 6	BEGM	10 ml
Filtro 12 millimetri	1.13 cm 2	2 x 10 5	BEGM	400 ml
Filtro 24 millimetri	4.52 cm 2	8 x 10 5	BEGM	800 ml

Tabella 2: media estrapolazione per il conteggio delle cellule.

5. Utilizzando una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungere il volume appropriato di virus alla sospensione cellulare.
6. Aggiungere bromuro hexadimethrine a 2 mg / ml concentrazione finale.
7. Dispensare 400 microlitri della miscela (BEGM, HBE cellule, virus e hexadimethrine bromuro) per inserto supporto permeabile nel vano apicale, e aggiungere 1 ml di BEGM solo al vano basolaterale. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2. cellule Sempre piastra HBE senza virus come il controllo e la selezione di test puromicina, se applicabile.
8. Il giorno successivo, remmezzi apicale e basolaterale ove, lavare con PBS, e sostituire entrambi i comparti con l'interfaccia aria-liquido (ALI) supporto ^8.
9. Quando le cellule sono confluenti, rimuovere il liquido apicale (noto come stabilire una interfaccia aria-liquido). Continuare cambiando il mezzo (ALI) nel comparto inferiore a giorni fino a raggiungere la piena maturità; di solito da 3 a 4 settimane dopo.
   Nota: Se il vettore lentivirale contiene un gene di selezione, come puromicina, le cellule possono essere selezionate aggiungendo puromicina secondo una curva concentrazione selezione. Per le cellule HBE, una concentrazione di 1 mg / ml è stato determinato per essere ideale per la selezione consistente di cellule trasdotte. Tuttavia, questa concentrazione potrebbe differire per le altre cellule o condizioni e deve essere determinata uccidendo curve. L'aggiunta di puromicina può iniziare già a partire un giorno dopo i media è stato sostituito dai media ALI o successivi (2-3 giorni) per consentire la piena espressione del gene di selezione. Assicurarsi di aggiungere puromicina a un inserto che hcome non è stata trasdotte. Puromicina può essere aggiunto finché le cellule sono completamente differenziate.

Risultati

La figura 1 illustra diversi passaggi chiave della valutazione cellule e soluzioni durante il processo di trasfezione. Figura 1A mostra la confluenza ottimale delle cellule HEK293T prima trasfezione per produzione di virus. È importante che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il piatto. Figura 1b rivela il precipitato in una goccia della miscela di trasfezione usando ottica in campo chiaro e un obiettivo 10X. Quanto più ...

Discussione

Il protocollo qui delineato assicura quasi il 100% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, ci sono passaggi durante il processo che sono importanti per raggiungere questo obiettivo. Per esempio, durante il processo di trasfezione, la presenza di precipitati nel mix trasduzione (drop) o nel piatto il giorno dopo trasduzione (figure 1b e d) sono entrambi rilevanti per una buona trasfezione. L'assenza di un precipitato o la presenza di agglomerati può essere dovuto ad una omissione di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	12306C	use at 10%
DMEM	Thermo Scientific	11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x)	Thermo Scientific	15140-122	use at 1x
Collagen I	BD Biosciences	354231	dilute 1:75 in distilled water
Calphos	Clontech	631312	Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000	VWR scientific	101108-210	stock of 40%
Amphotericin B	Sigma	A9528	use at 1x
Trypsin	Sigma	T4799
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Transwell 12mm	Corning	3460
Collagen IV	Sigma	C7521	dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x)	Thermo Scientific	A11138-03	use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA	PerkinElmer	NEK050001KT
F12	Thermo Scientific	11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro	System Biosciences	CD532A-2	lentiviral expression vector
pMD2-VSVG	Addgene	12259	packaging DNA
pMDLg/pRRE	Addgene	12251	packaging DNA
pRSV-rev	Addgene	12253	packaging DNA